[发明专利]一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的转基因果蝇模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型及其构建方法，尤其涉及一种转基因果蝇模型及其构建方法。

背景技术

Eph受体组成了受体酪氨酸激酶的最大家族，与它们的膜结合配体ephrin在胚胎图式形成、神经靶向、血管发育和成体新血管形成中发挥重要作用。有越来越多的证据表明Eph受体信号通路促进人体许多肿瘤的的发生，如直接促进肿瘤生长或通过形成肿瘤血管间接促进肿瘤形成。Eph受体及其配体在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤中被检测到过量表达。

特别是EphB4，它是Eph家族中研究的最多的蛋白。使用小干扰RNA或反义寡核苷酸链抑制EphB4的表达会进而抑制细胞的增殖、存活和PC3前列腺癌细胞的侵袭。使用可溶的EphB4的胞外结构域会抑制肿瘤生长。干扰内皮细胞中EphB4的信号通路会改变肿瘤血管的形态。这些观察提示我们EphB4在肿瘤及其血管生长中发挥重要作用。EphB4（又称HTK）和它的配体ephrinB2（HTKL），在血管和淋巴管网络的发育中发挥重要作用。EphB4特异表达在静脉上皮细胞，而ephrinB2在血管和淋巴管网络发育的早期阶段特异表达在动脉上皮细胞。小鼠中，EphB4基因的缺陷将会导致毛细血管连接的障碍，并最终导致小鼠在胚胎期死亡。胚胎发生中，EphB4表达在血细胞生成和血管发育的部位。EphB4在乳腺组织中的异常表达引起乳腺结构的无序、组织功能的损坏以及倾向于发生癌变。

Nai-Ying Yang等发现EphB4调节小鼠黑色素瘤细胞的迁移。恶性程度高的黑色素瘤细胞表达更高水平的EphB4，迁移的也比恶性程度低的快。当抑制EphB4的正向信号通路时，肿瘤细胞迁移也变慢。与此相比，活性EphB4的过表达明显增强了细胞的迁移能力。EphB4在细胞迁移和细胞形态上的效应需要它的激酶活性，当在细胞里过表达无激酶活性的EphB4时，细胞的迁移受到抑制。Nai-Ying Yang在文章中提到EphB4之所以可以调节细胞迁移是因为参与肌动蛋白的重新改造。Heroult M等甄选了一组人类肿瘤细胞系，并确定都有EphB4的表达。

由于易于饲养及便于遗传学操作，果蝇被成功的作为模式生物应用到发育遗传学、信号转导和细胞生物学的研究。高水平的基因和信号的保守性，以及哺乳动物与果蝇之间的细胞生理生化过程的相似性，使果蝇模型便于研究人类基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的果蝇模型的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供以下具体技术方案：

由雄性转基因果蝇与雌性GMR-Gal4的处女蝇杂交得到子I代果蝇，挑其所述子I代果蝇的的处女蝇与yw/Y;+/Cyo雄蝇杂交，后代挑选翘翅rough eye的雄蝇，即为果蝇模型中的雄性果蝇；用得到的果蝇模型中的雄性果蝇与+/FM7;+/Cyo杂交，后代挑选bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，得到的雌蝇再与果蝇模型中的雄性果蝇杂交，后代挑选无bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，即为果蝇模型中的雌性果蝇。

所述雄性转基因果蝇的基因型为EphB4 Kinase domain/Y或EphB4 Kinase domain。

所述雄性转基因果蝇是将5’端具有来自酵母上游激活序列的人EphB4 Kinase domain，整合到果蝇染色体基因组中得到的。

所述雄性转基因果蝇的制备方法为：

第一步，先进行载体的构建，即将PUAST 改造为 PUAST-EGFP载体。

第二步，将PUAST-EGFP改造为 PUAST-MYR-EGFP转基因载体：首先设计引物制备得到十四烷酰化修饰识别序列(MYR，SEQ ID NO:1)，将双酶切的十四烷酰化修饰识别序列插入到同样酶切的PUAST-EGFP载体中即得到 PUAST-MYR-EGFP转基因载体；

第三步，PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒的构建：将人hEphB4 基因的Kinase domain（即SEQ ID NO:4）克隆进PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体里，形成PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒；