[发明专利]一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法

权利要求书

1.一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的收集

将尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝接种于PDB液体培养基，振荡培养后，收集孢子；将孢子转移到YEPD液体培养基中，振荡培养后，收集菌丝；

2）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的制备

a、在步骤1）收集的菌丝中加入原生质体裂解缓冲液，振荡培养；

b、过滤酶解混合物，离心，弃上清液，收集原生质体沉淀；

c、在原生质体沉淀中加入STC缓冲液重悬，离心，弃上清液；再重复步骤c两次；

d、在步骤c的沉淀中加入STC缓冲液重悬至2-5×10⁷个原生质体/mL；

3）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的转化

a、在原生质体悬浮液中加入pBHt2-eGFP质粒，混匀后静置；再加入40%PTC缓冲液，混匀后静置；最后加入TB3培养基，室温振荡培养；

b、将步骤a得到的培养物离心，弃上清液，用STC缓冲液重悬；再加入未凝固的BottomAgar培养基，混匀后倒平板，室温培养；最后将未凝固的Top Agar培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出；

c、挑取单个转化子到含有200μg/mL潮霉素的PDA培养基上，筛选培养，得到纯和转化子。

2.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述原生质体裂解缓冲液的加入量为5mL/0.25-0.30g菌丝。

3.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述pBHt2-eGFP质粒的加入量为5-6μg/200μL原生质体悬浮液。

4.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述PDB培养基：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体至烧杯中，加入葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；所述PDA培养基：取灭菌前的PDB培养基1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

5.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述YEPD培养基：取酵母提取物3.0g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述原生质体裂解缓冲液：取Driselase 500mg，Lysing enzyme 100mg，加入1.2M KCl溶液至20mL，室温振荡30min，4000rpm离心6min，吸取上清液，用0.45μm细菌过滤器过滤除菌。

7.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述STC缓冲液：取蔗糖50g，0.5M Tris-Cl（pH=8.0）25mL，CaCl₂·2H₂O1.838g，补纯水至250mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

8.根据权利要求1或7所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述PTC缓冲液：取PEG8000 20g，补STC缓冲液至50mL，在65℃水浴锅中溶解，用0.45μm细菌过滤器过滤除菌。

9.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述TB3培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

10.根据权利要求1所述的一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，所述Bottom Agar培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂粉10g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却后再加入200μg/mL潮霉素和50μg/mL头孢霉素；所述Top Agar培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂粉15g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却后再加入300μg/mL潮霉素和50μg/mL头孢霉素。