[发明专利]一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，属于生物技术领域。

背景技术

芝麻枯萎病是由尖孢镰刀菌芝麻专化型（Fusarium oxysporum f.sp.sesami(Zaprometoff)Castellani）引起的一种重要的土传真菌病害，在世界范围内芝麻种植区域均有不同程度发生。在我国，芝麻枯萎病对芝麻生产危害较为普遍，一般流行年份发病率为5-15%左右，大发生时可达30%以上，严重影响芝麻的产量和品质，因此对于尖孢镰刀菌芝麻专化型致病特征的研究非常重要。由于芝麻病害研究起步较晚，研究基础薄弱，至今鲜少有对芝麻枯萎病菌致病机理进行深入研究的报道。

近年来，随着尖孢镰刀菌的基因组测序的完成以及芝麻枯萎病菌功能基因组学研究的尝试，缺乏合适的遗传转化体系成为进一步深入研究的重要限制因素。因此，建立一种简单、高效、稳定的遗传转化方法对于研究芝麻枯萎病致病机理具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，包括以下步骤：

1）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的收集

将尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝接种于PDB液体培养基，振荡培养后，收集孢子；将孢子转移到YEPD液体培养基中，振荡培养后，收集菌丝；

2）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的制备

a、在步骤1）收集的菌丝中加入原生质体裂解缓冲液，振荡培养；

b、过滤酶解混合物，离心，弃上清液，收集原生质体沉淀；

c、在原生质体沉淀中加入STC缓冲液重悬，离心，弃上清液；再重复步骤c两次；

d、在步骤c的沉淀中加入STC缓冲液重悬至2-5×10⁷个原生质体/mL；

3）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的转化

a、在原生质体悬浮液中加入pBHt2-eGFP质粒，混匀后静置；再加入40%PTC缓冲液，混匀后静置；最后加入TB3培养基，室温振荡培养；

b、将步骤a得到的培养物离心，弃上清液，用STC缓冲液重悬；再加入约50℃未凝固的Bottom Agar培养基，混匀后倒平板，室温过夜培养；最后加入约50℃未凝固的Top Agar培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出；

c、挑取单个转化子到含有200μg/mL潮霉素的PDA培养基上，筛选培养，转接5代后得到纯和转化子。

尖孢镰刀菌芝麻专化型转化子的检测

a、PCR检测：根据转化入尖孢镰刀菌芝麻专化型转化子的筛选标记基因序列设计特异引物，以SDS法快速提取的转化子DNA作为模板进行PCR扩增，随后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小。

b、荧光显微镜观察

将PCR检测为阳性的转化子菌丝和分生孢子悬浮液分别制成临时玻片，用荧光显微镜观察其由蓝紫光激发出的绿色荧光。

所述原生质体裂解缓冲液的加入量为5mL/0.25-0.30g菌丝。

所述pBHt2-eGFP质粒的加入量为5-6μg/200μL原生质体悬浮液。

所述PDB培养基：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体至烧杯中，加入葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述PDA培养基：取灭菌前的PDB培养基1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述YEPD培养基：取酵母提取物3.0g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述原生质体裂解缓冲液：取Driselase 500mg，Lysing enzyme 100mg，加入1.2M KCl溶液至20mL，室温振荡30min，4000rpm离心6min，吸取上清液，用0.45μm细菌过滤器过滤除菌。

所述STC缓冲液：取蔗糖50g，0.5M Tris-Cl（pH=8.0）25mL，CaCl₂·2H₂O 1.838g，补纯水至250mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述PTC缓冲液：取PEG800020g，补STC缓冲液至50mL，在65℃水浴锅中溶解，用0.45μm细菌过滤器过滤除菌。