[发明专利]一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-01制备胶原蛋白小肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-01制备胶原蛋白小肽的方法，属于生物技术技术领域

背景技术

胶原蛋白（collagen）是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物的骨、腱、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种水不溶性蛋白质。由于其具有特殊的结构，很难被生物学降解，所以只有少数的蛋白酶能够在特定的条件下水解胶原纤维，这类酶被称为胶原蛋白酶。胶原蛋白酶在医学、食品学和材料学上有着广泛应用，常被应用于细胞培养、富含胶原的肉食品（如牛肉）加工、胶原沉积性疾病如烧伤、手术后过度增殖性瘢痕的降解、腰椎间盘突出症等病症的治疗。

胶原蛋白肽是天然胶原蛋白经降解处理后制成的，具有较高的消化吸收性，相对分子质量为2000～30000道尔顿的肽段。胶原蛋白多肽产物由于其独特的生理功能及特点，可用于开发多种功能性健康食品；同时，胶原多肽以其独特的分子结构和较小的分子量、良好的渗透性、与皮肤良好的相容性等优势，已成功地应用于保湿型化妆品。这些预示着胶原蛋白肽将有非常广阔的市场前景。

目前胶原蛋白活性肽的获得方法包括从天然生物体中提取、通过化学方法和重组DNA技术合成、体外水解蛋白质等。然而天然产物中活性肽含量很少，只能提取用于试验研究；化学合成法成本高，副产物对人体有害；重组DNA技术合成法多用于生产长肽和蛋白质，而许多活性肽却是短肽。所以体外水解蛋白质成为获得活性肽的有效方式。随着酶制剂工业的迅猛发展，酶法水解比传统的酸水解、碱水解法更为温和、安全、专一，不仅降解时间短，产品营养流失较少，而且无环境污染。目前市场常用的小肽制备的酶有植物性蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、细菌性蛋白酶(枯草杆菌的碱性蛋白酶、中性蛋白酶)、动物蛋白酶（胰酶、胶原酶）等；但是目前尚没有深海来源的细菌胶原蛋白酶在胶原小肽制备中的应用的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-01制备胶原蛋白小肽的方法。

术语说明

胶原蛋白小肽：是指分子量小于1000Da的肽段占85%以上的胶原蛋白肽。

一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-01制备胶原蛋白小肽的方法，包括如下步骤：

（1）将海洋胶原蛋白酶MCP-01溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶浓度为0.3～0.5mg/mL的酶液；

（2）按照重量体积比为18～22:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在45～50℃的水浴锅中反应24～26小时，在4℃条件下，13000转/分钟离心10～15min，制得胶原蛋白肽；

（3）上述胶原蛋白肽经过截留量为3000Da的超滤管超滤离心，收集下层滤过物，即制得胶原蛋白小肽。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中，Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，pH9.0。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中，酶液中酶浓度为0.4mg/mL。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中，牛肌腱I型不可溶胶原蛋白与酶液的重量体积比为20:1。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中，反应条件为50℃的水浴锅中反应24小时。

本发明的优良效果：

本发明根据海洋细菌胶原蛋白酶MCP-01催化结构域的特点，设计最佳降解条件，使海洋胶原蛋白酶MCP-01高效降解胶原蛋白，产生的胶原蛋白肽分子量大部分低于10000Da，制得的胶原蛋白小肽中分子量小于1000Da的肽段占85%以上，从而使其降解产物在医药、食品、化妆品等高附加值领域中具有巨大的应用潜力。

附图说明：

图1.SDS-PAGE分析MCP-01催化结构域的异源表达的电泳图；

图2.SDS-PAGE分析纯化的重组酶纯度的电泳图；

图3.Tricine-SDS-PAGE检测重组MCP-01催化结构域降解胶原蛋白的电泳图；

图4.HPLC分析重组MCP-01催化结构域降解胶原蛋白的高压液相峰值图;

其中：A，对照；B，海洋胶原蛋白酶MCP-01在50℃酶解胶原蛋白24h；C，海洋胶原蛋白酶MCP-01在27℃酶解胶原蛋白24h。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)菌株购自TransGen Biotech；