[发明专利]体外培养杀伤性T细胞的方法

权利要求书

1.一种培养人细胞毒性T细胞的方法，其包括如下步骤：

a）获得无菌人全血50-100ml；

b）用PBS按照1：1比例稀释上述人全血，在塑料离心管中预先加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液，按分离液：稀释后血液=1：1～5的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面；

c）室温下1800rpm离心10～30min后弃上清，重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心8min；弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心5min；

d）弃上清，细胞沉淀用培养基RPMI-1640悬起，计数淋巴细胞数量；

e）按2×10⁶个细胞/ml的密度将所分离的细胞悬于RPMI-1640无血清培养液中，悬浮培养于25cm²小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL-2；

f）第二天或第三天，每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗CD3单克隆抗体；

g）第五天或第六天，每瓶培养的细胞按1：3比例传代于75cm²中培养瓶，并加入终浓度为0.4～1.6mg/ml的FS；

h）第八天至第十天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平，

其中FS是指大青叶水煎剂。

2.根据权利要求1所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于无菌人全血的体积为50ml。

3.根据权利要求1或2所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，按分离液：稀释后血液=1：2的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面，室温下1800rpm离心20min分离单个核细胞。

4.根据权利要求1到3任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于培养当日培养基中加入终浓度500U/ml的IL-2，次日加入50ng/ml抗CD3单克隆抗体，第5日加入0.4～1.6mg/ml的FS。

5.根据权利要求4所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于第5日加入1mg/ml的FS。

6.根据权利要求1到5任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述FS的制备方法为：取适量大青叶干药材，冷水浸泡20-30分钟，3次水煎混合液浓缩至约1g/ml，离心取上清液以⁶⁰CO照射灭菌。

7.根据权利要求1到6任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于步骤a）的无菌人全血为50ml。

8.根据权利要求1到7任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述PBS为0.01M、pH7.2的PBS。

9.据权利要求1到8任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述IL-2为重组人IL-2，所述抗CD3单克隆抗体为鼠抗人CD3单克隆抗体。

10.根据权利要求1到9任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于培养至第八天至第十天时回收细胞加入1%人血清白蛋白。