[发明专利]体外培养杀伤性T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外培养杀伤性T细胞的方法。更具体地，本发明涉及利用IL-2、抗CD3单克隆抗体和大青叶水煎剂体外联合诱导刺激培养人细胞毒性T细胞的方法。

背景技术

以肿瘤的免疫治疗为基础的肿瘤生物治疗作为现代肿瘤治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤的免疫治疗包括主动特异性免疫治疗（肿瘤疫苗）和被动免疫治疗，其中被动免疫治疗包括细胞因子疗法（白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等）、抗体为基础的被动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗（如LAK、TIL、CIK等）以及基因治疗。而其中过继性细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy，ACI）是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞（特异性的和相对特异性的）直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。过继性细胞免疫治疗可以单独用于临床治疗肿瘤患者，更重要的是可以作为手术、放疗、化疗的补充，与上述三种疗法联合应用，提高疗效和改善患者生存质量。因此，ACI近年来一直是肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域。自1985年Rosenberg报道应用LAK/IL-2治疗晚期恶性肿瘤以来，ACI研究进入了高潮，新的免疫效应细胞如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、抗CD3抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）、多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）不断被发现和应用，细胞体外扩增技术和免疫效应细胞杀伤活性的调变方面也有了较大的发展，使得ACI的临床应用在国内外得以广泛开展并取得了较好的疗效。

相关文献已有活化的T细胞的培养方法，包括CIK、CTL、LAK细胞培养的报道。但LAK细胞T细胞增殖数量有限，杀伤功能不高。CTL作为特异性细胞毒性T细胞，培养时需用肿瘤组织诱导，使培养受到限制。CIK细胞培养需4种因子联合刺激，操作步骤较多，试剂成本高。

本发明的目的是解决上述技术的不足，开发一种提取操作简单、细胞成熟时间短、细胞杀伤功能强的T细胞的培养方法，为肿瘤免疫治疗的广泛推广奠定基础。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于探索新的步骤更简便的人细胞毒性T细胞的诱导培养方法。

因此，本发明的第一方面涉及一种培养人细胞毒性T细胞的方法，其包括如下步骤：

a）获得无菌人全血50-100ml；

b）用PBS按照1：1比例稀释上述人全血，在塑料离心管中预先加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液，按分离液：稀释后血液=1：1～5的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面；

c）室温下1800rpm离心10～30min后弃上清，重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心8min；弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心5min；

d）弃上清，细胞沉淀用培养基RPMI-1640悬起，计数淋巴细胞数量；

e）按2×10⁶个细胞/ml的密度将所分离的细胞悬于RPMI-1640无血清培养液中，悬浮培养于25cm²小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL-2；

f）第二天或第三天，每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗CD3单克隆抗体；

g）第五天或第六天，每瓶培养的细胞按1：3比例传代于75cm²中培养瓶，并加入终浓度为0.4～1.6mg/ml的FS；

h）第八天至第十天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平，

其中FS是指大青叶水煎剂。

优选地，无菌人全血的体积为50ml。

优选地，按分离液：稀释后血液=1：2的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面，室温下1800rpm离心20min分离单个核细胞。

优选地，培养当日培养基中加入终浓度500U/ml的IL-2，次日加入50ng/ml抗CD3单克隆抗体，第5日加入0.4～1.6mg/ml的FS。

更优选地，第5日加入1mg/ml的FS。

优选地，所述FS的制备方法为：取适量大青叶干药材，冷水浸泡20-30分钟，3次水煎混合液浓缩至约1g/ml，离心取上清液以⁶⁰CO照射灭菌。

优选地，步骤a）的无菌人全血为50ml。

优选地，所述PBS为0.01M、pH7.2的PBS。