[发明专利]突变噬菌体E基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用

权利要求书

1.突变噬菌体E基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述的突变噬菌体E基因的制备方法，其特征在于顺次包括以下步骤：

1）通过序列为SEQ ID NO：3所示的引物1和序列为SEQ ID NO：4所示的引物2进行PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列为SEQ ID NO：2所示；

2）对序列为SEQ ID NO：2所示的E基因进行点突变，E基因点突变后的序列为SEQ ID NO：1所示。

3.含权利要求1所述的突变噬菌体E基因的打孔载体。

4.如权利要求3所述的打孔载体，其特征在于：该打孔载体是将权利要求1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体可操作性相连接得到的。

5.一种构建权利要求4所述的含突变噬菌体E基因的打孔载体的方法，其特征在于：使用序列为SEQ ID NO：5所示的引物3和序列为SEQ ID NO：6所示的引物4将权利要求1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。

6.一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在含氨苄青霉素的LB中接种含权利要求3的打孔载体的基因工程大肠杆菌，培养后提取表达载体质粒；

2）使用电极仪或者氯化钙转化法表达载体质粒转入禽沙门氏菌中，在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养，通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌；

3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达；

4）收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱，用纯水洗涤，－20℃保存。

7.如权利要求6所述的制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于：步骤1）

所述表达载体质粒通过如下方法获得：把突变噬菌体E基因与pMD18－T载体相连接，然后转入Top感受态细胞，并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上，放入37℃培养箱；等培养板干了之后，倒置培养10－14h，挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒；使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切；突变噬菌体 E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起，然后转入Top感受态细胸，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。

8.如权利要求6或7所述的制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于：步骤3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达可通过下面两种方法进行：

a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养；

b) 温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，在42℃的温度下进行诱导培养。