[发明专利]突变噬菌体E基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发是明涉及一种经基因突变后获得的PhiX174噬菌体E基因的DNA及其制备方法，还涉及含有该DNA的打孔质粒载体，还进一步涉及该打孔质粒载体在制备疫苗菌脱中的应用，属于生物基因工程领域。

背景技术

在细菌中表达PhiX174噬菌体E裂解基因，能够通过渗透压的作用使细菌的细胞膜破裂，造成细菌细胞内的胞浆和核酸成分流出，而形成一种空的细菌外壳，即为“bacterial ghost”(菌脱)。由于菌脱和活菌具有一样的细菌膜结构担保和相关抗原蛋白，与通过甲醛等化学方法灭活的细菌比较其刺激机体产生免疫反应的抗原物质未发生变性，因此菌脱是良好的候选疫苗。目前E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎少门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、支气管败血博德特氏杆菌等。但是，如果菌脱作为疫苗使用，尤其是对于强致病性细菌时，此时就需要菌脱中不含活菌，否则在使用菌脱免疫动物时，容易造成动物因感染强致病性活菌而发病。虽然菌脱已经广泛应用于革兰氏阴性菌中，对于Top10、DH5a等基因工程大肠杆菌的裂解效果较好，而对于野生型大肠杆菌或者其革兰氏阴性菌的裂解效果一般。因此，有必要提高E基因的裂解效果。

禽沙门氏菌病在世界各地普遍存在，对养禽业的危害性很大。提高E基因对禽沙门氏菌的裂解效果，有利于增加禽沙门氏菌菌脱作为候选疫苗的可能性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种突变噬菌体E基因；

本发明的目的之二在于提供上述突变噬菌体E基因的制备方法；

本发明的目的之三在于提供含上述突变噬菌体E基因的打孔载体；

本发明的目的之四在于构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法；

本发明的目的之五在于将上述突变噬菌体E基因应用于制备禽沙门氏菌菌脱疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种突变噬菌体E基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。该突变噬菌体E基因相对于PhiX174噬菌体E基因在禽少门氏菌中的表达量大大提高。

一种突变噬菌体E基因的制备方法，其特征在于顺次包括以下步骤：

1）通过引物1（SEQ ID NO：3）和引物2（SEQ ID NO：4）进行PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列为SEQ ID NO：2所示；

2）对序列为SEQ ID NO：2所示的E基因进行点突变，E基因点突变后的序列为SEQ ID NO：1所示。

将本发明的突变噬菌体E基因与pMD18-T等可操作性载体连接，即可得到打孔载体。

具体地，一种构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法，使用引物3（SEQ ID NO：5）和引物4（SEQ ID NO：6）将上述的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。

一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在含氨苄青霉素的LB中接种含权上述突变噬菌体E基因的打孔载体的基因工程大肠杆菌，培养后提取表达载体质粒；

2）使用电极仪或者氯化钙转化法把表达载体质粒转入禽沙门氏菌中，在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养，通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌；

3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达；

4）收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱，用纯水洗涤，-20℃保存。

优选地，步骤1）所述表达载体质粒通过如下方法获得：把突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接，然后转入Top感受态细胞，并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上，放入37℃培养箱；等培养板干了之后，倒置培养10-14h，挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒；使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切；突变噬菌体E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起，然后转入Top感受态细胸，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。

优选地，步骤3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达可通过下面两种方法进行：

a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养；

b)温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，在42℃的温度下进行诱导培养。