[发明专利]一种体外扩增NK细胞的方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及NK细胞的培养扩增方法，具体涉及一种体外大量扩增NK细胞的方法。 

[背景技术]

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是属淋巴细胞谱系，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞。其对靶细胞的识别无MHC限制性,无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞,也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能,是机体天然免疫的主要承担者,也是获得性细胞免疫的核心调节细胞,在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得性免疫细胞的一些特征。在免疫系统中，NK细胞反应的速度比T细胞或B细胞要快，其作用机制主要是识别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些肿瘤细胞，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。但由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(<10％)，仅占单个核细胞的5%-10%，极大的限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，但是目前的常规技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和γ-IFN等因子组合来促进NK的扩增，经过一段时间的培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，因此也不能满足实际的应用。并且这种方法因子需求量较大，成本较高，培养效果不稳定，不适合体外大规模的应用。 

[发明内容]

为了解决现有技术中NK细胞扩增后纯度不理想、成本较高等问题，本发明提供一种新的NK细胞的体外扩增的方法，可在体外培养条件下获得大量的、细胞纯度高、杀伤活性强的NK细胞。 

为实现上述目的，设计一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步骤组成： 

a.将外周血单个核细胞接种在CD3McAb和CD226McAb预包被的培养瓶中共培养， 

b.加入IL-2和IL-18共培养72小时以刺激扩增NK细胞， 

c.将NK细胞与经致死处理的K562细胞和含有IL-2和IL-18的无血清培养基转入细胞培养袋中共培养， 

d.收获NK细胞。 

本发明还有如下的优化方案： 

用CD3McAb和CD226McAb可用作促进IL-2和IL-18的合成和ADCC作用。 

用CD226提升NK细胞中表面活化分子CD69的表达水平、细胞因子IFNγ的分泌和杀伤颗粒CD107a的表达水平。 

步骤b具体为，加入IL-2和IL-18，并放入37℃、5%CO2的饱和湿环境中培养72小时。 

步骤c具体为，根据细胞生长情况持续补充含有IL-2和IL-18的无血清培养基。 

步骤c中，所述的NK细胞与经致死处理的K562细胞的细胞数比例为1:1。致死处理为K562细胞经100Gy剂量的γ射线照射致死。 

外周血单个核细胞的浓度优选为1.5×10⁶/ml。所述CD3 McAb的使用优选浓度为100ng/ml。所述CD226 McAb的使用浓度为优选50ng/ml~200ng/ml。所述CD226 McAb的最佳使用浓度为100ng/ml。所述IL-2使用浓度优选为500IU/ml。所述IL-18使用浓度优选为5ng/ml~50ng/ml。所述IL-18最佳使用浓度为10ng/ml。所述无血清培养基还含有人血白蛋白，人血白蛋白使用浓度为0.5%。 

与常规的仅单纯向培养体系中添加多种细胞因子的NK细胞培养方法相比，本发明具有如下优点： 

1.将CD3McAb和CD226McAb两种抗体同时包被，不仅CD3可促进细胞因子合成和ADCC作用，同样作为NK细胞活化受体的CD226的功能也得到证实，CD226可以引起NK细胞表面活化分子CD69的表达升高，细胞因子(IFNγ)的分泌与杀伤颗粒(CD107a，GranzymeB)的表达都明显升高，显著提高了NK细胞的杀伤毒性； 

2.转袋处理：在包被的培养瓶中培养3天后，再将细胞转入细胞培养袋中，这样既可以保证NK细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡，并且同等条件下细胞培养袋的效果要优于细胞培养瓶；