[发明专利]一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法

权利要求书

1.一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于培养方法及步骤如下：

（1）先制备原代鸡胚成纤维细胞（CEF），在CEF细胞制备后20-28h，将猪伪狂犬病毒（PRV）弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞（CEF），得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒；

（2）制备传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞单层，将DF-1细胞用8%血清的DMEM

DMEM培养基进行驯化，放置于37℃，CO₂含量为5%的恒温培养箱中培养；

（3）当DF-1细胞传代后40～48h，细胞密度为90-100%单层时，将制备的PRV弱毒种毒按0.8%～1%（v/v）的接种剂量接种到DF-1细胞单层，加入含2%血清的DMEM培养基，放置于37℃，CO₂含量为5%的恒温培养箱中继续培养；

（4）接种病毒后DF-1细胞会产生细胞病变，观察细胞病变，当细胞病变达到85%时，收获病毒液；

（5）将收获的病毒液按1:1的比例与冻干保护剂混合，经真空冷冻冻干，即成猪伪狂犬活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于：步骤（1）收获的猪伪狂犬病毒弱毒种毒的病毒液，反复冻融3次后按常规方法测病毒的半数感染量（TCID₅₀）达到10^7.0TCID₅₀/ml以上。

3.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于：所述的DMEM培养基为国内清大天一的DMEM培养基，其中含1.5g碳酸氢钠/升，DMEM培养基调PH到7.0-7.2。

4.根据权利要求1中所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于：其中步骤（2）、（3）中所述的血清为国产血清，选为杭州四季青胎牛血清、武汉三利胎牛血清、兰州民海优级新生牛血清和济南劲牛新生牛血清中至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述的冻干保护剂中每100ml含有5g蔗糖和10g的脱脂奶粉。

6.根据权利要求1或2中所述的一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于：所述的猪伪狂犬弱毒株为Bartha K61毒株。