[发明专利]一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活苗的方法。

背景技术

伪狂犬病又称Aujeszky氏病，是由伪狂犬病病毒（Pseudora-bies virus,PRV）所引起的多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、流产、奇痒（除猪外）、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病毒归属疱疹病毒科（Herpesviridae）甲型疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae of alphavirinae），因此也成猪疱疹病毒?型（Suid herpesvirus ?）、传染性延髓麻痹病病毒或奇痒症病毒。该病毒的感染谱极广，以表明有40种动物可以被感染，猪是该病毒的最重要的储存宿主和带毒者，因而对该病毒的传播起着重要的作用。由于被感染动物种类极多，病毒可在自然界反复循环存在，属于典型的自然疫源性疾病，也是极难防制的传染病之一。

猪发生伪狂犬病以后，其临床症状取决于感染猪的年龄、病毒株的毒力感染途径和剂量。成年及母猪主要表现为呼吸症状，多呈一过性，是带毒和排毒的主要来源。可致怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎儿和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率更高达100%，断奶仔猪发病率可达40%，死亡猪已日益增多。

本病目前尚无特效治疗药物，疫苗的免疫接种是预防和控制伪狂犬病的根本措施，目前国内外已研制出伪狂犬的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗都能在一定程度上减轻或防治伪狂犬病的临床症状，从而减少造成的经济损失。

但是目前猪伪狂犬病毒活疫苗的制备方法中普遍用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）培养PRV弱毒的方法，这种方法存在操作过程复杂繁琐、毒价低、批间差大、生产成本高、大量生产受制于 SPF 蛋的供应，而且容易引入外源病毒或其它污染源、很容易造成疫苗质量不稳定等缺陷。

另外，DF-1 细胞系最早由美国明尼苏达大学动物科学系 Douglas Foster  博士于 1998 年改良而成的，起源于 10 日龄的 ELL-0（来航）鸡胚成纤维细胞（CEF），是自发永生性的，可以无限繁殖。它有着成纤维细胞的典型的细胞形态。DF-1 细胞逆转录酶阴性，没有禽类肉瘤和白血病病毒的内源性基因序列，所以是非致瘤性的。DF-1 细胞系是经美国食品与药物管理局（FDA）授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。 DF-1 细胞对鸡传染性法氏囊病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒、劳氏肉瘤病毒、火鸡疱疹病毒均易感，禽类病毒在 DF-1 细胞上的病变更加剧烈，更加明显，可以在 DF-1 细胞上进行复制，并且可以形成明显的细胞病变。DF-1 细胞具有很好的增殖潜力，和鸡胚成纤维细胞相比，DF-1 细胞的密度可以比大 4 倍以上。因此，用DF-1细胞生产猪PRV活疫苗是目前的一个主要研究方向。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术的不足而提出一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法，该方法利用传代鸡胚成纤维细胞（DF-1）代替原代鸡胚成纤维细胞CEF培养PRV弱毒，并对培养工艺进行系统的优化，以克服复杂繁琐、成本过高，且容易造成疫苗质量不稳定的缺陷。

本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：

（1）先制备原代鸡胚成纤维细胞（CEF），在CEF细胞制备后20-28h，将猪伪狂犬病毒（PRV）弱毒株接种原代鸡胚成纤维细胞（CEF），得到猪伪狂犬病毒弱毒种毒，收获的猪伪狂犬病毒弱毒种毒的病毒液，反复冻融3次后按常规方法测病毒的半数感染量（TCID₅₀）应达到10^7.0TCID₅₀/ml以上。

（2）制备传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)细胞单层，将DF-1细胞用含8%血清的DMEM培养基进行驯化，放置于37℃，CO₂含量为5%的恒温培养箱中培养。其中所述的DMEM培养基中含1.5g碳酸氢钠/升，PH调到7.0-7.2。

（3）当DF-1细胞传代后约40～48h，细胞密度为90-100%单层时，将制备的PRV弱毒种毒按0.8%～1%（v/v）的接种剂量接种到DF-1细胞单层，加入含2%血清的DMEM培养基，继续放置于37℃，CO₂含量为5%的恒温培养箱中继续培养。其中所述的DMEM培养基中含1.5g碳酸氢钠/升，PH调到7.0-7.2。