[发明专利]一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及运用改良K-N法组份Ⅳ沉淀制备人α1-抗胰蛋白酶的方法，属血浆蛋白领域。

背景技术

α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1antitrypsin AAT)。分子由394个氨基酸组成,分子量为52000的糖蛋白,以天然有活性及变性无活性两种形式存在,由肝脏产生,主要功能为抑制胰蛋白酶和中性白细胞的弹性蛋白酶的活性,还可抑制糜蛋白酶,纤维蛋白溶酶等，为人体内功能最强大的酶抑制剂之一。AAT先天性缺乏如基因突变或后天因素如长期吸烟或细菌感染会造成AAT活性中心失活，都会导致AAT功能性不足进而造成机体蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡,肺组织抵抗弹性蛋白酶的能力下降,引起肺泡变形及末端小支气管以及下肺空间扩张等肺组织的慢性损害,会发生泡性肺气肿，慢性阻塞性肺病（COPD），成人呼吸道窘迫症（ARDS），现阶段美国FDA批准的临床适应症为α1-抗胰蛋白酶遗传性缺乏引起的肺气肿，临床上一直就存在着采用AAT制剂进行增补治疗的需求。由于α1-抗胰蛋白酶自身具备抗炎，抗感染以及抗自身免疫反应等多功能特性，故在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease IBD），脂膜炎，脉管炎，鼻窦炎，风湿性关节炎，糖尿病1型，糖尿病所引起足病，囊性纤维化（粘滞症），支气管扩张，肌纤维痛，某些皮肤病像牛皮癣等常见慢性疾病具备潜在治疗价值。

国外公司在进行扩大适应症方面的尝试并取得了进展，扩大的适应症为支气管扩张（Bronchiectasis）和囊性纤维化疾病(Cystic fibrosis)，糖尿病1型。另有国外公司采用基因重组技术基于酿酒酵母系统表达的重组α－1抗胰蛋白酶rAAT,剂型为胶体，进行了特应性皮肤病的临床试验。rAAT也在进行针对其它皮肤炎症，例如银屑病以及中耳炎的临床前研究。至今国内没有商品供应临床治疗需要。开发AAT能有利于宝贵的血浆资源的综合利用，极大地提升血浆蛋白生产的附加利润。因此开展AAT的研发不仅有很好的经济效益而且会有极佳的社会效益。

国内外文献及专利报道α1-抗胰蛋白酶剂提纯原料常为Cohn法组分Ⅳ-1。科恩等Coan et al：Preparation and Properties of Alpha 1-ProteinaseInhibitor Concentrate from Human Plasma Vox Sang.48:333-342(1985)发表的采用Cohn法组分Ⅳ-1为原料，两步PEG沉淀，第一步为11.5%为去除杂蛋白，第二步28%为富集沉淀α1-抗胰蛋白酶，再经一步DEAE-Sepharose CL-6B层析，巴氏法病毒灭活，该制剂含有12%白蛋白，2.5%IgA,具备生物活性即抑制猪弹性蛋白酶（PPE活性）的AAT仅占总蛋白含量的60%，基于此工艺，美国Bayer公司开发出全世界第一个α1-抗胰蛋白酶产品海因等Hein et al：Production of Alpha 1-Proteinase inhibitor(Human)Eur.RespirJ.9:16s-20s(1990)发表的工艺采用Cohn法组分Ⅳ-1为原料，采用PEG沉淀和阴离子交换层析，最终产品的纯度为60%。朱威等：α1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活，中国生物制品杂志，2001，14（2）：97-101发表了Cohn法组分Ⅳ抽提液经两次沉淀，第一次去杂，第二次富集α1-抗胰蛋白酶及离子交换批量吸附及凝胶过滤纯化α1-抗胰蛋白酶，工艺中仅采用一次病毒灭活，采用的是巴氏法。有改为两步病毒灭活措施的必要，并且工艺中有PEG4000用量大的缺陷。莱宾等Lebing et al：美国专利No.6,462,180:采用CoanⅣ-1为原料，经PEG沉淀，再经两步离子交换层析。病毒灭活方法采用去污剂（Tween20）,纳米过滤，冻干后干热病毒灭活，此发明中病毒灭活工艺较为繁复，可以进一步优化。卜凤荣等：专利申请号：200610103642.X，发明名称：α1-抗胰蛋白酶的制备方法，公开了采用组分Ⅳ-1为原料，提取α1-抗胰蛋白酶，病毒灭活方法为S/D病毒灭活和巴氏消毒法的组合，但制备采用PEG沉淀加一步阴离子交换层析，纯度还达不到高纯的标准。