[发明专利]一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法

权利要求书

1.一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于生产方法及步骤如下：

（1）猪细小病毒种毒的制备：将从液氮中复苏的IBRS-2细胞转瓶传代，待细胞长成单层时，弃去培养液，将猪细小病毒接种到IBRS-2细胞，接种剂量为0.01MOI，接种后换2%血清的维持液培养，待IBRS-2细胞病变达80%以上时收获病毒液，将收获的病毒液进行病毒滴度测定和无菌检验，病毒液的TCID₅₀≥ 10^6.5TCID₅₀/ml，无菌检测合格作为猪细小病毒种毒；

（2）IBRS-2细胞接种激流式生物反应器：先将转管培养的IBRS-2细胞用胰蛋白酶进行消化，当消化下来的细胞液总体积为4升，细胞个数达到约2×10⁹时，将细胞液用蠕动泵打入激流式反应器的纸片载体中，进行细胞的繁殖培养，培养细胞时激流式生物反应器的温度设定为37℃，pH设定为7.2～7.4，溶氧设定为30~60%；

（3）生物反应器细胞接种猪细小病毒：当激流式生物反应器中细胞密度达到1×10⁷个细胞/ml时，将制备的猪细小病毒种毒接种到激流式生物反应器中培养的IBRS-2细胞，接种剂量为0.01MOI，接种后静置吸附1h，病毒培养时激流式生物反应器设定温度为36.5℃，pH设定为7.4～7.6，溶氧设定为30~60%，振荡器转速55rpm/min；

（4）接毒60h后，收获繁殖的病毒液，灭活，配苗即得到猪细小病毒灭活疫苗。

2.根据专利要求1所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（3）中向生物反应器接种病毒前，应先将生物反应器中培养液全部排空，用预热的无菌PBS循环冲洗细胞2遍，排空PBS，再用蠕动泵将预热的种毒打入灌注袋中，接种后向生物反应器的激流袋内打入培养基。

3.根据专利要求1所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的病毒液的收获包括细胞上清液和含有纸片载体的灌注袋中的病毒液，病毒液中病毒含量每毫升不低于10^8.0TCID₅₀，病毒液对豚鼠红细胞血凝效价不低于1:512的可用。

4.根据专利要求1所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的灭活是用甲醛灭活，向病毒液中加40%的甲醛溶液，边加边混合，至混合液中甲醛溶液终浓度为0.3%时，停止加入，然后将病毒灭活液置于37℃温室中放置48h，期间振摇3～4次，然后将病毒灭活液置于2～8℃保存。

5.根据专利要求1所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的配苗是将含白油的油相和含病毒液的水相乳化均匀，步骤为将油相打入乳化罐中，开动混合机至2000r/min低速转动搅拌，同时徐徐加入水相，加完后提转速至2900r/min乳化30～100min，乳化后，取10ml左右以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化一次。

6.根据专利要求5所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述的油相是将注射用白油94重量份，硬脂酸铝0.5重量份混合，然后再加6重量份的司班-80，在121℃下高压灭菌30min制成。

7.根据专利要求5所述的一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述的水相是将保存不超过1个月的病毒液96重量份， 0.01重量份的叠氮钠和0.015重量份的氧氟沙星混合晃匀，然后加入4重量份20～30℃的吐温－80，充分振摇至完全溶解制成。