[发明专利]一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法。

背景技术

猪细小病毒病（porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的只要疾病之一。主要表现为受感染的母猪，特别是经产母猪及血清学阴性经产发生流产，产死胎、畸形胎、木乃伊胎、弱胎及屡配不孕等，PPV感染后对胎儿也有危害，对其他年龄的猪感染后一般不表现明显的临床症状。该病在世界范围内广泛分布，大多数感染猪场呈地方性流行，猪群感染后很难净化，从而造成持续的经济损失，严重阻碍了全球养猪业的健康发展。PPV血清型单一，很少发生变异，但目前仍没有能有效地治疗的药物，因此，该病的免疫预防就显得更为重要。近年来，使用疫苗是预防猪细小病毒感染、提高母猪繁殖率的唯一方法。

传统转瓶生产工艺是目前成熟的IBRS-2及其他疫苗基质细胞培养方法。但由于该方法操作繁琐，传代环节多，产品易被污染，产品质量难控制等缺陷，为其大规模应用带来障碍。近年来，也有学者运用微载体生物反应器进行细胞的和病毒的培养，进而生产疫苗。以微载体Cytodex系列应用最广，但微载体使用前后均有较复杂的处理步骤，并且细胞的增殖也受到剪切力，代谢产物的积累等因素影响，同样难以大规模应用。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，而提出一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法，通过该方法可解决疫苗生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低、操作繁琐、传代环节多、产品易被污染等问题。

本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：

（1）猪细小病毒种毒的制备：将从液氮中复苏的IBRS-2细胞转瓶传代，待细胞长成单层时，弃去培养液，将猪细小病毒接种到IBRS-2细胞，接种剂量为0.01MOI，接种后换2%血清的维持液培养，待IBRS-2细胞病变达80%以上时收获病毒液，将收获的病毒液进行病毒滴度测定和无菌检验，病毒液的TCID₅₀≥ 10^6.5TCID₅₀/ml，无菌检测合格作为猪细小病毒种毒。

（2）IBRS-2细胞接种激流式生物反应器：先将转管培养的IBRS-2细胞用胰蛋白酶进行消化，当消化下来的细胞液总体积为4升，细胞个数达到约2×10⁹时，将细胞液用蠕动泵打入激流式反应器的纸片载体中，进行细胞的繁殖培养，培养细胞时激流式生物反应器的温度设定为37℃，pH设定为7.2～7.4，溶氧设定为30~60%。

（3）生物反应器细胞接种猪细小病毒：当激流式生物反应器中细胞密度达到1×10⁷个细胞/ml时，将制备的猪细小病毒种毒接种到激流式生物反应器中培养的IBRS-2细胞，接种剂量为0.01MOI，接种后静置吸附1h，病毒培养时激流式生物反应器设定温度为36.5℃，pH设定为7.4～7.6，溶氧设定为30~60%，振荡器转速55rpm/min。

（4）接毒后60h后，收获繁殖的病毒液，灭活，配苗即得到猪细小病毒灭活疫苗。

其中本发明所述的步骤（3）中向生物反应器接种病毒前，应先将生物反应器中培养液全部排空，用预热的无菌PBS循环冲洗细胞2遍，排空PBS，再用蠕动泵将预热的种毒打入灌注袋中，接种后向生物反应器的激流袋内打入培养基。

其中本发明所述的步骤（4）中所述的病毒液的收获包括细胞上清液和含有纸片载体的灌注袋中的病毒液，将含有纸片载体的灌注袋中的病毒液经3次反复冻融后离心去除细胞碎片，再与细胞的上清液混合，放置于-20℃保存备用。将收获的混合病毒液测定病毒滴度和红细胞凝集价，病毒液中病毒含量每毫升不低于10^8.0TCID₅₀，病毒液对豚鼠红细胞血凝效价不低于1:512的可用。

其中本发明所述的步骤（4）中所述的灭活是用甲醛灭活，向病毒液中加40%的甲醛溶液，边加边混合，至混合液中甲醛溶液终浓度为0.3%时，停止加入，然后将病毒灭活液置于37℃温室中放置48h，期间振摇3～4次，然后将病毒灭活液置于2～8℃保存。

其中本发明所述的步骤（4）中所述的配苗是将含白油的油相和含病毒液的水相乳化均匀，步骤为将油相打入乳化罐中，开动混合机至2000r/min低速转动搅拌，同时徐徐加入水相，加完后提转速至2900r/min乳化30～100min，乳化后，取10ml左右以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化一次。