[发明专利]隐色孔雀石绿半抗原、人工抗原及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，涉及抗原的制备，具体地涉及一种隐色孔雀石绿半抗原、人工抗原及制备方法。 

背景技术

孔雀石绿（Malachite Green，MG），别名中国绿、苯胺绿、碱性孔雀石绿、品绿、盐基块绿等，是一种有毒的三苯甲烷类化合物，过去常作为外用驱虫剂、杀真菌剂、杀菌剂等用于治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染。但是孔雀石绿也是潜在的致癌剂、致突变剂、致畸变剂，目前世界上许多国家都已经将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。隐色孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG）是孔雀石绿的无发色团还原产物，是孔雀石绿在鱼体及其他生物体内的主要代谢产物和存在形式，其不溶于水，在体内残留时间更长，危害亦比孔雀石绿更大。孔雀石绿和隐色孔雀石绿具有如式（Ⅰ）所示的结构： 

式（Ⅰ） 

但是，由于部分生产者和商贩缺乏有关科学知识和法律意识，特别是受到经济利益的驱使，在水产养殖过程中还是会经常用到防治水霉病效果好且价格低廉的孔雀石绿。2005年，我国福建、江西、安徽等省出口欧盟、日本、韩国 的鳗鱼产品先后被检出孔雀石绿残留。2006年，上海市场上的多宝鱼和香港市场上的桂花鱼，均被检出孔雀石绿残留。孔雀石绿的非法使用，严重威胁了人民的身体健康，严重影响了我国水产品在国际上的竞争力，同时造成了重大的经济损失。然而在巨大经济利益的趋势下，短期内很难真正做到杜绝孔雀石绿在水产养殖中的应用，这就使得快速准确地检测出水产品中残留的孔雀石绿和隐色孔雀石绿成为当务之急。 

以往对于孔雀石绿和隐色孔雀石绿的残留检测主要是采用气相色谱法和液相色谱法，但是需要使用昂贵的设备仪器且操作繁琐，不适用于现场快速检测。免疫分析检验技术是近年来在环境、食品安全检测领域逐渐广泛应用的一种快速、高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，也为孔雀石绿和隐色孔雀石绿的检测提供了新的途径。 

CN 101245032A公开了一种隐色孔雀石绿半抗原，其保留隐色孔雀石绿的特征结构，在隐色孔雀石绿结构的不同化学位点上衍生出具有不同电子结构性质、不同碳链长度以及适合与大分子载体偶联的活性手臂，所述活性手臂为R基团、芳香胺、末端羧基直链烷基醚或带有直链末端羧基结构的酰胺键；由隐色孔雀石绿半抗原制备得到隐色孔雀石绿人工抗体，应用于检测隐色孔雀石绿和孔雀石绿的残留量。 

CN 101149375A公开了一种对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒，提供半抗原、包含与赋予抗原性的载体材料偶联的所述半抗原的免疫原、包含与标记物结合的所述半抗原的偶联物、以及对抗这样的免疫原并能与隐色孔雀绿和孔雀石绿结合的抗体。 

CN 101451999A公开了一种检测隐性孔雀石绿直接竞争ELISA试剂盒。所提供的酶联免疫试剂盒包括隐性孔雀石绿多克隆抗体、隐性孔雀石绿半抗原及 完全抗原和酶标抗原。 

但是以上各发明与现有技术一样，其抗体特异性与灵敏度较弱，检测时回收率太低，不能满足现有需要。 

发明内容

本发明目的之一在于提供一种隐色孔雀石绿半抗原。 

本发明提供一种隐色孔雀石绿的半抗原，通过修饰其不同化学位点，使其具有不同的空间构象、不同的电子云密度，然后通过半抗原的活性手臂与大分子载体偶联，制成隐色孔雀石绿人工抗原。 

半抗原的设计：在免疫分析方法研究中，制备高质量的抗体是关键，二抗体质量的优劣很大程度上取决于半抗原的结构（宏观立体机构与微观电子机构）是否合理。因此，设计合理的半抗原机构及选择合适的偶联蛋白方式非常重要。文献研究经验表明：制备高特异性抗体所需半抗原及人工抗原应能最大限度的保持药物分子的特征结构。从隐色孔雀石绿的结构看，电子云密度较高的二甲氨基取代的两个苯环系统可能是产生特异性抗体的决定性特征结构区。因此，半抗原设计中采取了避免在该药物特征结构区衍生化偶联手臂的策略。同时，为了研究半抗原的构效，考察不同衍生化方法及偶联微点对抗体特性的影响，分别在非取代苯环结构的间对位引入吸电子性质的羧基或偶联蛋白后扩大共轭体系的氨基活性基团。进一步的模拟计算结果表明：羧基衍生的半抗原偶联蛋白保持了药物分子的微观特征电子结构，可能有利于高特异性抗体的产生；氨基衍生物的半抗原偶联蛋白后，较小程度的改变了药物分子特征电子机构，对产生高特异性抗体产生的影响也较小。