[发明专利]一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法

权利要求书

1.一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是至少采用如下步骤：

（1）. 量子点标记蛋白液的制备：取浓度为1μM-10μM的0.2-2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mM~200mM 、pH6.0~7.4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照1μmol~5μmol EDC/2nmol量子点的比例加入EDC，EDC即碳二亚胺盐酸盐，涡旋振荡混匀，再按1nmol~100nmol 蛋白/1nmol量子点的比例加入浓度为1~10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1-4小时；反应结束后用截留分子量为10kDa-100kDa的离心超滤管超滤浓缩至20-100μL，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为0.2-2μmol/L，保存于10mM-100mM、 pH为7.4~9.0的、含有质量百分比浓度为0.05%的NaN₃的硼酸盐缓冲液中，2~8℃冰箱保存备用；

（2）. 量子点标记蛋白检测液的制备：将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS-TBN稀释100-1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS-TBN为含20mM-150mM氯化钠NaCl、0.02%-0.1% 吐温Tween-20、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白BSA、0.05% 叠氮化钠NaN₃的10mM-100mM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2~8℃冰箱保存备用；

（3）. 制备包被有检测指标的反应膜：检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1~5mg/mL，并将二抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1~5mg/mL，按照0.8~1.2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及二抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3~7mm，放置25~37℃烘箱处理1-3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM-150mM氯化钠NaCl、0.05%-3% 聚乙二醇PEG20000、0.2%-1% 海藻糖、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白BSA、0.05% 叠氮化钠NaN₃的10mM-100mM磷酸盐缓冲液PB；

（4）. 在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤（3）制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得量子点荧光免疫层析试纸条；

（5）. 定性或定量检测：取300uL-500μL量子点标记蛋白检测液与10μL -50μL待检测样本充分混匀后，取60μL-100μL混合液加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-15min即可读取结果；

（5.1）定性检测或半定量检测：采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域，通过肉眼观察条带发光情况，如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法，当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性；不出现荧光信号则为阴性；如果检测体系为检测小分子物质的竞争法，则结果相反，出现荧光信号的检测线报告为阴性，未出现荧光信号报告为阳性；无论采取哪种方法，如果控制线没有荧光信号则检测结果无效；

（5.2）定量检测：配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。

2.根据权利要求1 所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是：所述量子点为羧基水溶性核壳型量子点，量子点的发射波长范围是500nm-630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的荧光，其荧光量子产率不低于45%。

3.根据权利要求1 所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是：所述检测指标为抗原，则检测液中的标记抗体和反应膜检测区的包被抗体，应为相应检测指标对应的单克隆抗体。

4.根据权利要求1 所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是：所述检测指标为抗体，则其检测液中的标记抗原和反应膜检测区的包被抗原，应为相应检测指标对应的基因工程重组抗原。

5.根据权利要求1 所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是：所述样品垫为玻璃纤维垫，吸水垫为普通吸水纸。