[发明专利]桑黄菌中尿嘧啶的分离技术

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制药领域。

背景技术

桑黄（Phellinus），子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。

目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析， 常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。

发明内容

本发明公开了一种桑黄菌中尿嘧啶的分离方法。首先制备桑黄粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用石油醚与丙酮梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后适当合并洗脱液，减压干燥，既得尿嘧啶。

本发明的技术方案如下：

桑黄粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；

(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。

分离尿嘧啶的方法：

桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→TLC检测→减压蒸干→白色粉末（尿嘧啶）。

具体方法为：

(1)制备桑黄菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-7次；

(3)收集步骤（2）中最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；

(4)收集上述步骤（3）中的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；

(5)TLC检测步骤（4）的洗脱液，适度合并洗脱液，加压干燥，即为尿嘧啶。

本发明由桑黄菌中尿嘧啶的分离技术的显著优势：本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的尿嘧啶。技术路线成熟明确，高效精确。

（四）附图说明

图1为本发明尿嘧啶的结构式；

图2为尿嘧啶的一维核磁共振H谱

（五）具体实施方式

实例1：

桑黄粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1%             葡萄糖      1%