[发明专利]缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法与用途

权利要求书

1.一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）收集缢蛏血淋巴10 mL，4℃、4000 rpm下离心25 min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1.5 mL RNase-free的EP管，加入1 mL Trizol，吹打混匀后室温静置5 min，每管加500 μL氯仿，振摇30s，冰浴3 min，然后在4℃，12000 rpm下离心15 min，吸取上清液，转移至另外一支RNase-free 的EP管，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4℃预冷的500 μL异丙醇，混匀，冰上静置l0 min，4℃，12000 rpm离心15 min，弃上清；加1 mL 4℃预冷的75%乙醇洗一次，4℃，8000 rpm离心5 min，倒掉乙醇，室温倒置15 min，加10 mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4 ℃冷藏；

（2）按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增：

a. 反转录cDNA合成体系建立：

取20 μl缢蛏总RNA样品 70 ℃下温育10 min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系：

将上述体积的试剂混匀，42 ℃温育60 min，95 ℃变性5 min，然后4 ℃放置5 min； 

b. 嵌套PCR

  ①第一次PCR反应体系：

 

第一次PCR反应程序

 

②第二次PCR反应体系                                                 

第二次PCR反应程序

    

所述的引物分别为：

M13-MGDs   5'-ACAATTTCACACAGGAGATTGAGGTG-3   ；

锚定引物1  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTC-3'  ；

锚定引物2  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTG-3'  ；

锚定引物3  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTA-3’  ；

      M13   5'-ACAATTTCACACAGGA-3' ；

       T7     5'-ACGACTCACTATAGGG-3'  ；

（3）对3’RACE扩增产物进行切胶回收，与pMD18-T载体连接后，转化E. coli DH5α，长出菌落后，筛选阳性转化子，测序得到PCR产物基因序列，命名为scp基因；

（4）酵母表达载体构建：

在scp基因两端加上酶切位点EcoRI和XbaI，

正向引物SCPF: 5'-CGGAATTCATGAAGACATTCAGT-3'，下划线为 EcoRI 酶切位点，反向引物SCPR: 5'-GCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC-3'，下划线为XbaI 酶切位点，从阳性转化子中扩增scp基因，再与pMD18-T载体连接后，筛选获得阳性转化子，提取质粒，用EcoRI和XbaI酶切，切胶回收带有酶切位点的scp基因片段，和同样用EcoRI和XbaI酶切的质粒载体pPICZαA按10: 1的摩尔比进行连接，转化至E. coli DH5α中，用含25 μg/mL Zeocin的LB平板筛选阳性转化子，提取表达载体质粒；

（5）转化及PCR验证：

用Bst I 酶切线性化重组表达载体质粒，与酵母表达宿主GS115感受态细胞混匀，在1.5 kv，25 μF，200 Ω，5 msec条件下电击，立刻加入1 M山梨醇1 mL，混匀后吸取100 μL涂于含100 mg/L Zeocin抗生素的MD平板，30℃培养，直至长出酵母重组子菌落LGS-3；提取LGS-3的DNA，使用引物5'-AOX和3'-AOX以及SCPF和SCPR 进行PCR验证；培养LGS-3菌液，按LGS-3菌液：30%甘油体积比1:1保存菌种；

（6）重组蛋白的诱导表达：

将LGS-3菌液接种于含50 mL BMGY培养基的250 mL三角瓶中，30℃，200 rpm 培养24 h；离心弃上清，转接到含100 mL BMMY的500 mL三角瓶中，30℃，200 rpm培养，离心，得到含抗菌肽的上清液；

其中：MD培养基：13.4 g/L无氨基酵母氮源，0.4 mg/L生物素，20g/L葡萄糖，1.5%琼脂；

BMGY/BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物， 100 mM pH6.0磷酸钾缓冲液，1.34% 无氨基酵母氮源，0.4mg/L生物素，1%甘油，制备BMMY时用0.5%甲醇代替1%甘油；配置方法：取l0g酵母抽提物，20 g蛋白胨，溶于700 mL去离子水中，高压灭菌20 min，冷却至室温，加入过滤除菌后的10×无氨基酵母氮源，100 mL2 mL500×生物素，100 mL10×甘油，100 mLl mol/L磷酸钾缓冲液，4℃保存备用。

2.权利要求1所述的缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法所制得在含抗菌肽的上清液在制备抑制泥鳅病害抗菌肽制剂中的用途。