[发明专利]缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽的方法与用途，特别是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法与用途。

背景技术

随着水产养殖业的迅速发展，水产病害日趋严重，防治过程中抗生素甚至一些禁用药物的大量长期使用，不仅威胁食品安全，而且破坏了水生环境，许多细菌产生了明显的耐药性，影响了水产养殖业的可持续性发展。滥用抗生素也使我国水产品出口屡屡受阻，给水产业造成了巨大损失。因此寻求抗菌力强、抗菌谱广、活性稳定的抗菌素替代品成为防治水产病害的当务之急。

抗菌肽是生物体内产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，具有广谱抗菌活性，同时有“传统抗生素”无法比拟的优越性：不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。抗菌肽添加到养殖鱼类的饲料中，不仅可以抑制和消灭水生环境中的病原微生物，提高鱼体的免疫能力，而且可以避免抗生素在鱼体中的蓄积， 提高水产品质量。目前国内外研究以从生物体分离纯化抗菌肽为主，此方法得到的抗菌肽量少成本较高，因此很难得以广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的对水产疾病具有防治效果的缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供前述方法制得的抗菌肽的一种用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）收集缢蛏血淋巴10 mL，4℃、4000 rpm下离心25 min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1.5 mL RNase-free的EP管，加入1 mL Trizol，吹打混匀后室温静置5 min，每管加500 μL氯仿，振摇30s，冰浴3 min，然后在4℃，12000 rpm下离心15 min，吸取上清液，转移至另外一支RNase-free 的EP管，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4℃预冷的500 μL异丙醇，混匀，冰上静置l0 min，4℃，12000 rpm离心15 min，弃上清；加1 mL 4℃预冷的75%乙醇洗一次，4℃，8000 rpm离心5 min，倒掉乙醇，室温倒置15 min，加10 mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4 ℃冷藏；

（2）按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增：

a. 反转录cDNA合成体系建立：

取20 μl缢蛏总RNA样品 70 ℃下温育10 min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系：

将上述体积的试剂混匀，42 ℃温育60 min，95 ℃变性5 min，然后4 ℃放置5 min；

b. 嵌套PCR

  ①第一次PCR反应体系：

第一次PCR反应程序

②第二次PCR反应体系    

  

第二次PCR反应程序

所述的引物分别为：

M13-MGDs   5'-ACAATTTCACACAGGAGATTGAGGTG-3   ；

锚定引物1  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTC-3'  ；

锚定引物2  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTG-3'  ；

锚定引物3  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTA-3’  ；

      M13   5'-ACAATTTCACACAGGA-3' ；

       T7     5'-ACGACTCACTATAGGG-3'  ；

（3）对3’RACE扩增产物进行切胶回收，与pMD18-T载体连接后，转化E. coli DH5α，长出菌落后，筛选阳性转化子，测序得到PCR产物基因序列，命名为scp基因；

（4）酵母表达载体构建：

在scp基因两端加上酶切位点EcoRI和Xba I，