[发明专利]具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用

权利要求书

1.一种具有VEGFR₂/KDR受体特异性的融合毒素，是通过连接肽在白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的氨基端（N端）连接重组人血管内皮生长因子VEGF₁₂₁突变体（rhVEGF_121KDR）得到的融合毒素，且所述融合毒素的羧基端（C端）具有内质网定位序列。

2.根据权利要求1所述的融合毒素，其特征在于：所述连接肽的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1或2所述的融合毒素，其特征在于：所述内质网定位序列的氨基酸残基序列如序列表中序列SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求3所述的融合毒素，其特征在于：所述融合毒素，命名为rhVEGF_121KDR/rGEL30，是下述氨基酸残基序列之一：

1）序列表中的SEQ ID NO：1；

2）将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有VEGFR₂/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

5.编码权利要求1-4任一项所述融合毒素的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述编码融合毒素的基因（rhVEGF_121KDR/rGEL30)，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2）编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3）与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性并具有VEGFR₂/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

7.含有权利要求5或6所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

8.一种重组表达权利要求1-4任一项所述融合毒素的方法，是将含有权利要求5或6所述融合毒素编码基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合毒素；

构建所述重组表达载体的出发载体优选为包括一种含有硫氧化还原蛋白（Trx）突变体（mTrx）的融合表达载体pmTrx，该载体是以pET32a(+)序列为基础，将其Trx序列中的Gly34和Pro35位氨基酸残基突变为Pro34和Tyr35后得到的，所述硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

9.根据权利要求8所述的重组表达方法，其特征在于：以pmTrx载体为出发载体，构建的含有融合毒素编码基因的重组表达载体为pmTrx-rhVEGF_121KDR/rGEL30；所述重组表达载体中pmTrx-rhVEGF_121KDR/rGEL30中氨基端（N端）连接硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）标签的融合毒素编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述融合毒素基因上游添加限制性内切酶Xba I识别位点，下游添加限制性内切酶Not I识别位点；

转化或转导有重组表达载体pmTrx-rhVEGF_121KDR/rGEL30的宿主细胞中表达的融合蛋白具有mTrx标签，应用工具酶切割去除mTrx标签，最终得到融合毒素；所述用工具酶切割去除mTrx标签的方法为：按每1单位凝血酶裂解5毫克融合蛋白，室温消化过夜。

10.权利要求1-4任一项所述的融合毒素或权利要求5或6所述融合毒素的编码基因在制备抗肿瘤药物中的应用。