[发明专利]具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有VEGFR₂/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF₁₂₁突变体与白树籽核糖体失活蛋白的融合毒素（rhVEGF_121KDR/rGEL30）及其编码基因，以及该融合毒素的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。 

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康。根据国际抗癌联盟（UICC）统计数据，全球每年新增病例都在1000万人以上，死亡700多万人。目前，我国恶性肿瘤患者约2000万人，每年新增发病人数约180-200万，死亡约140-150万。 

传统化疗药物对机体肿瘤采取地毯式轰炸的杀灭方式，特异性差，且对骨髓、消化道、肝、肾等正常组织均造成严重损害，具有很大的局限性。近年来兴起的肿瘤靶向治疗改变了传统化疗药物全面杀伤所有快速分裂细胞的治疗方式，只针对肿瘤特定标志对肿瘤实施精确打击，定点清除，因此特异性高、抗癌效果好、毒副作用低，已成为将来抗癌药发展的主要方向。 

肿瘤血管靶向药物是肿瘤靶向治疗的重要领域。研究表明，肿瘤组织必须依赖其周围血管获得足够的营养和氧气、并排出有害代谢产物，才能迅速增长，否则肿瘤生长最多不超过2mm³。只要有效抑制肿瘤新生血管的形成，或者阻断肿瘤已有的血管网络，肿瘤细胞就无法获得足够营养而延缓生长，并逐渐萎缩、凋亡、坏死，最终被机体消除。 

在肿瘤血管形成过程中，血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体家族发挥重要作用，与肿瘤的生长、浸润和转移关系密切，是抗癌药物设计的重要靶标。人类VEGF由于mRNA的剪接而产生几种不同的异构体，即VEGF_121、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₈，其中VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅为可溶性的细胞因子，具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流动等功能。VEGF受体（VEGFR₁/Flt1和VEGFR₂/KDR）具有酪氨酸激酶活性，其中VEGFR₁/Flt1表达于所有分化成熟的血管内皮细胞表面，VEGFR₂/KDR则只在肿瘤组织的血管内皮细胞表面高表达，而在正常组织的血管内皮细胞表达水平很低乃至几乎无法检测出，是一种特异性比较高的肿瘤新生血管内皮细胞的生物标志。 

核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins，RIPs)是一类广泛存在于植物中的天然毒蛋白，它具有N2糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体的28S rRNA上4324位腺苷酸的N2C糖苷键，使核糖体失活，从而抑制蛋白质合成。根据肽链的组成和性质，RIPs通常分为两类：Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型为单链，Ⅱ型为双链，由一条类似I型RIP的肽链和一条具有凝集素活性的肽链通过二硫键连接形成。RIPs具有抗病毒和抗肿瘤等广泛的生物学和药学活性。RIPs已被用作免疫毒素的弹头，临床上用于治疗恶性肿瘤。其中，本发明所涉及的白树籽核糖体失活蛋白rGEL30是一种Ⅰ型RIP，又名GAP30或Gelonin，最初从亚热带植物白树（Gelonium multiflorum）的种籽中分离纯化而得，SDS电泳测定分子量约为30kD。以后克隆测序后，知其由251个氨基酸组成，准确分子量应为28kD，故亦可将基因重组的该蛋白称之为rGEL或rGelonin。已证明rGEL30具有对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤力强、对正常细胞毒性低的优点，是一种比较理想的抗肿瘤蛋白分子。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有VEGFR₂/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF₁₂₁突变体（rhVEGF_121KDR）与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素。 

本发明所提供的具有VEGFR₂/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF₁₂₁突变体与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素，是通过连接肽在白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的氨基端（N端）连接重组人血管内皮生长因子VEGF₁₂₁突变体（rhVEGF_121KDR）得到的融合毒素，且所述融合毒素的羧基端（C端）具有内质网定位序列。