[发明专利]利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法

权利要求书

1.一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）菌种的活化：将枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，进行活化；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为8.0；

（2）种子液的制备：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养至OD₆₀₀为1.4～1.6；再以体积百分比5%的接种量转接种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养5～10h；将菌液离心，取沉淀，用生理盐水悬浮沉淀，即得种子液；种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为8.0；

（3）中性蛋白酶发酵：中性蛋白酶发酵通过摇瓶好氧发酵或是发酵罐发酵进行：

①摇瓶好氧发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，25～30℃、150～200rpm摇瓶好氧培养至少36小时；

②发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，控制转速200～1000rpm，通气量0.5～2.0vvm，使溶氧控制在30%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比为25%的泡敌进行泡沫控制，培养至少36小时；

发酵培养基：木薯渣10～80g/L，豆粕粉10～40g/L，麸皮10～40g/L，Na₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄0.3g/L，pH为7.5～8.5；

（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：将步骤（3）得到的发酵液离心，上清液为中性蛋白酶粗酶液；沉淀干燥后，得到饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于还包含以下步骤：（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入硫酸铵，使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，取上清，在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到中性蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的离心的条件为4℃、10000rpm离心30min。

4.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌AS1.398。

5.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的离心的条件为4℃、5000rpm离心10min。

6.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（3）①中所述的摇瓶好氧培养的时间为36～72h。

7.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（3）②中所述的培养的时间为36～60h。

8.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的离心的条件为4℃、10000rpm下离心20min。