[发明专利]利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵生产领域，特别涉及一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法。

背景技术

中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，目前工业上主要利用枯草芽孢杆菌，以玉米粉为主要原料发酵生产。粮食的紧张和价格的波动导致中性蛋白酶价格的波动，阻碍了中性蛋白酶产业的发展。国家政策规划要求不与人争粮，解决成本和政策上的巨大挑战最有希望的途径就是以工农业废弃物为原料进行中性蛋白酶的生产。

木薯作为我国南方的主要经济作物，年产量约为600万吨，主要用于生产淀粉。每年加工淀粉产出大量的木薯渣，干木薯渣中残留了35%～45%的淀粉。目前大量的木薯渣未得到有效利用，既造成资源浪费又污染了环境。木薯渣中有大量的残留淀粉和蛋白质，可以代替玉米粉用于中性蛋白酶发酵。目前利用木薯渣为碳源生产高附加值产品中性蛋白酶的研究还未见报道。

原材料成本在中性蛋白酶发酵生产中占有较大比重，以工业废弃物——木薯渣为原料进行直接发酵，降低原料成本对于中性蛋白酶发酵生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法。该方法以木薯渣为原料不仅省去了原材料、预处理以及酶解糖化的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业的环境污染问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，包含以下步骤：

（1）菌种的活化：将枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，进行活化；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为8.0；

（2）种子液的制备：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养至OD₆₀₀为1.4～1.6；再以体积百分比5%的接种量转接种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养5～10h；将菌液离心，取沉淀，用生理盐水悬浮沉淀，即得种子液；种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为8.0；

（3）中性蛋白酶发酵：中性蛋白酶发酵通过摇瓶好氧发酵或是发酵罐发酵进行：

①摇瓶好氧发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，25～30℃、150～200rpm摇瓶好氧培养至少36小时；

②发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，控制转速200～1000rpm，通气量0.5～2.0vvm，使溶氧控制在30%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比25%的泡敌进行泡沫控制，培养至少36小时；

发酵培养基：木薯渣10～80g/L，豆粕粉10～40g/L，麸皮10～40g/L，Na₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄0.3g/L，pH为7.5～8.5；

（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：将步骤（3）得到的发酵液离心，上清液为中性蛋白酶粗酶液；沉淀干燥后，得到饲料添加剂；

所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，还包含以下步骤：（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入硫酸铵，使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，取上清，在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到中性蛋白酶；

步骤（1）中所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌AS1.398；

步骤（2）中所述的离心的条件优选为4℃、5000rpm离心10min；

步骤（3）①中所述的摇瓶好氧培养的时间优选为36～72h；

步骤（3）②中所述的培养的时间优选为36～60h；

步骤（4）中所述的离心的条件优选为4℃、10000rpm下离心20min；

步骤（5）中所述的离心的条件优选为4℃、10000rpm离心30min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：