[发明专利]一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：

第一试剂：含荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液；

磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

2.根据权利要求1所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原由碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。

3.根据权利要求1或2所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述第一试剂中的荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为0.5~1μg/mL，所述第一试剂的pH为7-9；所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL，所述第二试剂的pH为7-9。

4.一种如权利要求3所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于：所述含有碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液的制备过程如下：

①使三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2~8℃下保存备用，其中：所述的三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg；

②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.1~1.3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为0.5~1.5mg/ml。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，取三碘甲状腺原氨酸抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为20~50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应2~3小时，用二甲基亚砜将反应液1:10稀释，于2~8℃下保存备用。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤②中，取浓度大于等于5mg/ml的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液，用pH 9~10的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5~1.5mg/ml，加入步骤①所得反应液，室温静置反应20~60min。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为7~9的缓冲液，然后按照荧光素与三碘甲状腺原氨酸抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为7~9的缓冲液与三碘甲状腺原氨酸抗体的pH为7~9的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去的荧光素，得到含有荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得第一试剂。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述磁分离剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2~18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂；其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2μm，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量大于等于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。

9.根据权利要求4或7或8所述的制备方法，其特征在于：所述的具有适当pH值的缓冲液为含有0.5%牛血清白蛋白、pH8.0的TRIS缓冲液。

10.采用权利要求1~3中任一项权利要求所述的试剂盒用于对三碘甲状腺原氨酸定量检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）免疫反应：在检测管中加入待测样本原液，依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25~40℃下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25~40℃下进行第二次温育；

（2）洗涤：使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后磁分离，去除上清；

（3）加底物溶液检测发光强度：在检测管中加入碱性磷酸酶催化的化学发光底物，去除磁场，充分混悬后检测发光强度值。