[发明专利]几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法。

 

背景技术

蛋白酶(protease)是催化肽键水解的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功能。蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性，使其在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工业用酶。据估计当前世界工业生产酶市值10亿美元，蛋白酶为工业生产酶三大类之一，其约占总市值60％。利用不同的蛋白酶或相关的产酶微生物可以制备各种活性多肽。有关研究表明，利用蛋白酶水解大豆蛋白(或是直接用微生物发酵 )获得的大豆多肽能够有效抑制血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性，同时可以获得酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopep—tides，CPPs)、玉米肽等对人体非常有价值的活性多肽。现有技术采用的水解高产蛋白酶的菌株环境适应性较差，对高产蛋白酶的水解能力也较低。 

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法，特别是使2株枯草芽孢杆菌（Pc和Pe株）和1株地衣芽孢杆菌（Ps株）间的配伍比例达到最优，使其配伍后的水解豆粉的能力达到最强。

本发明提供的几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法，包括以下步骤：

（1）    平板培养，分别取Pc和Pe株枯草芽孢杆菌及Ps地衣芽孢杆菌保存菌种，划线接种至脱脂奶粉平板培养基，分别于35℃培养48h后观察；

（2）    试管接种，取发育健壮、菌落典型的菌株接种10ml种子培养基，170r/min，35℃振荡培养24h，再将菌种液以体积分数1％接种于发酵培养基，170r/min，35℃振荡培养48h，12000r/min离心20min，收集上清液；

（3）    取步骤（2）3种菌液各1ml，13000r/min离心25min，取上清分别以1:1比例配伍后，再与豆粉培养液以1:4比例混合，同时分别取单独Pc、Pe、Ps菌株上清与豆粉培养液以1:4比例混合，置于25℃恒温培养箱，酶解6h，测定氨基酸的变化。

所述步骤（1）中脱脂奶粉平板培养基是在TS（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）中加入1%琼脂糖和1%脱脂奶粉，0.06 MPa 高压灭菌10min，待温后倾注平板；所述步骤（2）中种子培养基是由蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5；所述步骤（2）中发酵培养基是由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5。

本发明提供的几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法，其有益效果在于，对高产蛋白酶菌株选择性强；Pe、Pc和Ps菌株环境适应性较好，Pe与Ps1:1配伍后产酶效果最好，有着远大的工业化前景，这将为进一步的研究奠定理论基础；方法科学、时间周期短。

 

具体实施方式

下面结合一个实施例，对本发明提供的几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法进行详细的说明。

 

实施例

本实施例的几株高产蛋白酶芽孢杆菌株的配伍优化方法，包括以下步骤：

（1）    平板培养，分别取Pc和Pe株枯草芽孢杆菌及Ps地衣芽孢杆菌保存菌种，划线接种至脱脂奶粉平板培养基，分别于35℃培养48h后观察；

（2）    试管接种，取发育健壮、菌落典型的菌株接种10ml种子培养基，170r/min，35℃振荡培养24h，再将菌种液以体积分数1％接种于发酵培养基，170r/min，35℃振荡培养48h，12000r/min离心20min，收集上清液；

（3）    取步骤（2）3种菌液各1ml，13000r/min离心25min，取上清分别以1:1比例配伍后，再与豆粉培养液以1:4比例混合，同时分别取单独Pc、Pe、Ps菌株上清与豆粉培养液以1:4比例混合，置于25℃恒温培养箱，酶解6h，测定氨基酸的变化，AA增量为52.5μmol/ml。

所述步骤（1）中脱脂奶粉平板培养基是在TS（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）中加入1%琼脂糖和1%脱脂奶粉，0.06 MPa 高压灭菌10min，待温后倾注平板；所述步骤（2）中种子培养基是由蛋白胨15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5；所述步骤（2）中发酵培养基是由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5。