[发明专利]一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶A1的方法

权利要求书

1.一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET-pla，保藏编号为CCTCC No.M 2012423，其特征在于：该重组大肠杆菌包含一段来源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M2012423，其特征在于由下述方法制得：

（1）以所述液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因组为模板，克隆得到所述pla基因；

（2）将步骤（1）所得pla基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体pET-pla；

（3）将步骤（2）所得重组载体pET-pla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶A₁的重组大肠杆菌。

3.用权利要求1～2任一项所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCCNo.M 2012423制备磷脂酶A₁的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶A₁。

4.根据权利要求3所述制备磷脂酶A₁的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）种子培养：将经过斜面培养的所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423单菌落接种于种子培养基，于35～37℃振荡培养5～7h，摇床转速180～200r/min；

（2）自诱导发酵培养：将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比1~4％的接种量接种至自诱导发酵培养基，于35～37℃振荡培养3～5h小时，摇床转速180～200r/min；再向所述自诱导发酵培养基中分别添加其总重量0.5～2％的甘氨酸和曲拉通，继续培养12～14h；发酵完毕，得到发酵液；

（3）粗酶液的提取：将上述发酵液离心，收集上清液，即得含磷脂酶A₁的粗酶液。

5.根据权利要求4所述制备磷脂酶A₁的方法，其特征在于步骤（1）所述斜面培养的培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化钠1，其余成分为水，调节pH值至7.4；所述种子培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na₂HPO₄ 25mM，KH₂PO₄ 25mM，NH₄Cl 50mM，Na₂SO₄ 5mM，MgSO₄ 2mM，其余成分为水。

6.根据权利要求4所述制备磷脂酶A₁的方法，其特征在于步骤（2）所述自诱导发酵培养基成分以1L计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，甘油5g，Na₂HPO₄ 25mM，KH₂PO₄ 25mM，NH₄Cl 50mM，Na₂SO₄ 5mM，MgSO₄ 2mM，FeCl₃ 50μM，CaCl₂ 20μM，其余成分为水。