[发明专利]一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶A1的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一株重组大肠杆菌及用该菌株进行自诱导发酵来制备磷脂酶A₁的方法。 

背景技术

磷脂酶A₁（PhospholipaseA₁，EC 3.1.1.32，简称PLA₁）属于水解酶，可专一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷脂和游离脂肪酸。磷脂酶A₁是一种优良的表面活性剂，被广泛应用于食品、医药、饲料和皮革等领域；此外，磷脂酶A₁还可应用于植物油脱胶，同传统脱胶方法相比，磷脂酶A₁脱胶这种新型脱胶方法具有反应条件温和、副产物少、节能环保等优点，近年来已在油脂精炼行业得到大规模推广。 

经证实，许多动物的细胞、组织和毒液含有少量的磷脂酶A₁。磷脂酶A₁的传统来源为动物胰液，但该来源提取量有限且价格昂贵，已于近几年逐渐被淘汰，取而代之的是从微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A₁大多与细胞膜结合，难以进行规模化生产，因此，研究磷脂酶A₁基因在工程菌中的克隆表达并努力提高其产量成为近年来的主要研究方向。国内外利用微生物产磷脂酶A₁的起步较晚，且产量普遍较低：1988年，Michael Givskova等从液化沙雷氏菌中提取磷脂酶A₁基因在大肠杆菌克隆和表达，其酶活不到1U/ml（Givskov M，Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase from Eseherichia.coli[J].Mol.Microbiol，1993(8)：229-42.）；2000年，M.Hartmann等使用随机化学突变、单细胞融合以及基因杂交技术，筛选出4株嗜热四膜虫属突变株，其酶活最高达到35.2±2.60U/ml（Hartmann M，etal.Screening forand charaeterization ofphospholipase A₁ hypersecretory mutants  of Tetrahymena thermophila[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，2000(54)：390-396）；2008年，国内付建红等从新疆天山一号冰川冻土中筛选到一株产低温碱性磷脂酶A₁的菌株xjF1，初步优化后，酶活力最高达17.5U/ml（付建红，唐辉桂，姚斌，等.一株产低温碱性磷脂酶A₁耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究.工业微生物2008.38：12-16.）。目前商品化 的磷脂酶A₁产品仅有丹麦诺维信公司的Lecitase Novo^TM(Novozymes A/S)，其是通过蛋白质修饰技术由来源于嗜热丝胞菌的脂肪酶改性而来。 

因此，寻找更加优良的磷脂酶A₁基因并在工程菌中进行克隆表达以期提高其表达水平是亟待解决的问题。 

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株重组大肠杆菌及用该菌株制备磷脂酶A₁的方法。利用该菌株通过液体发酵制备磷脂酶A₁，具有产酶量和酶活性高、生产工艺简单、成本低、易于工艺放大等优点。 

本发明的技术方案如下： 

一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET-pla，保藏编号为CCTCC M 2012423，该重组大肠杆菌包含一段来源于液化沙雷氏菌CICCNo.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

其进一步的技术方案为： 

所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-pla，CCTCC No.M 2012423由下述方法制得： 

（1）以所述液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因组为模板，克隆得到所述pla基因； 

（2）将步骤（1）所得pla基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体pET-pla； 

（3）将步骤（2）所得重组载体pET-pla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶A₁的重组大肠杆菌。