[发明专利]贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

包拉米虫（Bonamia）是严重危害贝类养殖业的主要疾病，包拉米虫病（Bonamiasis）为OIE规定的必报贝类传染病之一。该病虫体寄生在贝类的血淋巴细胞中，可引起相当高的流行率和死亡率。派琴虫(Perkinsus)派琴虫病能使贝壳不能闭合,套膜收缩,性腺发育抑制,生长缓慢,偶尔也会出现脓肿,死亡率可高达95%。这两种原虫是贝类最易感并且致死率也非常高的病，更为严重的是,人们食用了感染派琴虫的贝类还可能出现呕吐、腹泻等不适症状，因此迫切需要建立一种快速敏感的包拉米虫和派琴虫的检测方法，在感染早期就能检测出这些病原，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。

目前，国内检测这两种原虫的方法有组织和细胞学检测法、电镜检测法、原位杂交法和RFTM检测法等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。

目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对贝类包拉米虫和派琴虫进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的引物组。

本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。

本发明的另一个目的是提供检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂A。

本发明提供的试剂A由上述的引物组、探针A和探针B组成；

所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C；

所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料D。

上述试剂中，所述报告荧光染料A为ROX，所述报告荧光染料B为FAM；所述淬灭荧光染料C为ECLIPSE1,所述淬灭荧光染料D为ECLIPSE2；

所述试剂中所述引物1、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为2:2:2:1:1:1。

本发明的第三个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR试剂B。

本发明提供的试剂B，由上述的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。

本发明提供的试剂B，所述引物1、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0.4μM；

所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为0.2μM。

本发明的第四个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B。

上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有贝类包拉米虫和/或派琴虫产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有贝类包拉米虫和/或派琴虫为用上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光RT-PCR反应。

若在610nm激发光下（ROX）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有包拉米虫；反之，则样品中不含有包拉米虫；

若在530nm激发光下（FAM）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有派琴虫；反之，则样品中不含有派琴虫；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均为S型曲线，则样品中含有包拉米虫和派琴虫；