[发明专利]轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组和检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组和检测方法。

背景技术：

轮状病毒(rotavirus)是世界范围内病毒性胃肠炎的重要病因。目前对轮状病毒感染引起的胃肠炎治疗尚无特效药物。无论在发达国家或是发展中国家，由轮状病毒引起的腹泻均有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的最主要病因。

轮状病毒在离体条件下存活力很强，对各种理化因子有较强抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反复冻融、超声波处理都不能使其失活，且这类病毒的序列变异较大，有多种血清型存在。近年来，轮状病毒引起的胃肠炎流行在世界范围内有不断上升的趋势，且流行范围广，传染性强，二次攻击率高，常造成急性严重的呕吐和腹泻。虽然不同病毒感染的症状轻重不一，但一般患者都具有低烧、呕吐、腹泻、头痛等严重的脱水样胃肠炎的症状。人群对这几种病毒普遍易感，儿童和老人最为严重，为胃肠炎病毒的危险人群。虽然轮状病毒胃肠炎的流行有一定的季节性，但全年均可发生，可呈暴发流行，也可呈散发流行，因此致使对其不能进行及时有效的防护。

目前轮状病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。与上述几种实验室诊断方法相比，近年来新建立的环介导等温扩增（LAMP）技术由于其对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确检测轮状病毒探索一种新方法。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种应用环介导等温扩增检测轮状病毒(rotavirus)的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测轮状病毒(rotavirus)。

本发明的应用环介导等温扩增检测轮状病毒(rotavirus)的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物F3：5’-ACCACTCCTTAATGCACAA-3’；（如SEQ ID NO.1所示）；

下游外引物B3：5’-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’；（如SEQ ID NO.2所示）；

上游内引物FIP：5’-CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3’；（如SEQ ID NO.3所示）

下游内引物BIP：5’-ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3’（如SEQ ID NO.4所示）。

本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的轮状病毒的检测方法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，再反转录成cDNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对cDNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品可以为医院的腹泻样品，以及水、食品等。

所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对cDNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO₄、12.5μL2mol/L甜菜碱、4μL灭菌双蒸水ddH₂O，1μL8U/μL Bst DNA聚合酶和1μL cDNA，反应条件为在温度为65℃孵育60min。

所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在终止反应的反应管中加入1μL 10% SYBR Green Ⅰ显色剂，10min后观察结果，如果颜色为黄色，则样品轮状病毒阴性，无轮状病毒，如果颜色为绿色，则样品轮状病毒阳性，含有轮状病毒。