[发明专利]一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，所述病毒分别为番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番茄黄化曲叶病毒和广东番茄曲叶病毒，其特征在于：包括如下步骤：

（1）设计检测上述病毒的引物

检测番茄黄化曲叶病毒的引物为TYF和TYR，PCR扩增产物大小为321bp；

TYF：5’-GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’；

TYR：5’-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’；

检测台湾番茄曲叶病毒的引物为TWF和TWR，PCR扩增产物大小为209bp；

TWF：5’-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’；

TWR：5’-AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’；

检测广东番茄黄化曲叶病毒的引物为TYGF和TYGR，PCR扩增产物大小为118bp；

TYGF：5’-TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’；

TYGR：5’-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3’；

检测广东番茄曲叶病毒的引物为TGF和TGR，PCR扩增产物大小为81bp；

TGF：5’-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’；

TGR：5’-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’；

（2）采用CTAB方法提取待检病样品的总DNA；

（3）PCR反应

以步骤（2）中提取的DNA为模板，步骤（1）中的4对引物为引物在同一体系中进行PCR反应；

（4）结果鉴别

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察，如有321bp大小的特异性条带，即确认病样品是由番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有209bp大小的特异性条带，即确认病样品是由台湾番茄曲叶病毒侵染引起的；如有118bp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有81bp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄曲叶病毒侵染引起的；如产生上述2条、3条或4条特异带，则表明病样品分别是由相应的2种、3种或4种病毒混合侵染引起的；如无上述任何特异条带，则该病样品不是4种病毒中任何1种侵染引起的。

2.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的PCR反应体系为50μL反应体系包括2μL待检病样品的总DNA、0.25μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶、5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液、1μL浓度10mM的dNTPs、浓度为3μM的上述引物各1.5μL、灭菌双蒸水29.75μL。

3.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的PCR反应的条件为：94℃预变性8min；94℃变性30sec、60℃退火45sec、72℃延伸45sec，32个循环；72℃最终延伸10min。

4.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的琼脂糖凝胶电泳为在质量体积百分比为1.5～2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，100～125V恒压电泳35～50min。

5.实现权利要求1～4任一项所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液和引物；

所述引物分别为：

TYF：5’-GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’；

TYR：5’-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’；

TWF：5’-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’；

TWR：5’-AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’；

TYGF：5’-TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’；

TYGR：5’-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3’；

TGF：5’-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’；

TGR：5’-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’。