[发明专利]一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，特别涉及番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番茄黄化曲叶病毒和广东番茄曲叶病毒这4种病毒单独或混合侵染引起番茄黄化曲叶病的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

对于番茄黄化曲叶病毒等植物病毒的检测鉴定，现有技术主要有2种：血清学检测方法和聚合酶链式反应（PCR）检测鉴定方法。

血清学检测方法，主要包括制备抗体、病样制备、包被检测板、加入抗体、加标记的羊抗兔抗体、显色反应等步骤。虽然市场上可以购买到少数植物病毒的商品化抗体，但绝大部分植物病毒的抗体还是需要研究者自己制备；另外，血清学检测时，抗体还会与亲缘关系较近的病毒存在交叉反应，产生假阳性结果。对于上述引起番茄黄化曲叶病的4种病毒尤其如此，它们的外壳蛋白较保守，其抗体与不同病毒间均存在不同程度的血清学交叉反应。因此，事先制备出待检测病毒特异、高效价的抗体是该技术的关键。该技术工作量大，专业性强；同时，该鉴定过程至少需要2天，鉴定时间较长，需要购买特殊设备酶标仪。

PCR检测鉴定方法，主要包括根据已知病毒保守序列设计PCR引物、在PCR管中加入反应成分、PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法较特异、快速、灵敏，成本也较低，需要购买PCR仪。目前利用PCR检测一种病毒需要6小时左右，若检测鉴定4种病毒，至少需要24小时。

番茄黄化曲叶病是我国目前番茄生产上重要病害，番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、台湾番茄曲叶病毒（Tomato leaf curlTaiwan virus，ToLCTWV）、广东番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curlGuangdong virus，TYLCGuV）和广东番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Guangdongvirus，ToLCGuV）等侵染均可引起该病害。由于这些病毒侵染均引起番茄黄化、曲叶症状，无明显差异，加之田间番茄常受2种或2种以上病毒混合侵染，要明确某一病样是哪种或几种病毒侵染引起的，用上述这二种方法中任何一种方法进行检测与鉴定，均需要24小时以上，而且血清学检测方法还难以鉴定到病毒种类。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，这4种病毒分别为番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番茄黄化曲叶病毒和广东番茄曲叶病毒。

本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，所述病毒分别为番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）、台湾番茄曲叶病毒（ToLCTWV）、广东番茄黄化曲叶病毒（TYLCGuV）和广东番茄曲叶病毒（ToLCGuV），包括如下步骤：

（1）设计检测上述病毒的引物，其位置简图见图1。

检测番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的引物为TYF和TYR，PCR扩增产物大小为321bp；

TYF：5’-GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’；

TYR：5’-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’；

检测台湾番茄曲叶病毒（ToLCTWV）的引物为TWF和TWR，PCR扩增产物大小为209bp；

TWF：5’-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’；

TWR：5’-AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’；

检测广东番茄黄化曲叶病毒（TYLCGuV）的引物为TYGF和TYGR，PCR扩增产物大小为118bp；

TYGF：5’-TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’；

TYGR：5’-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3’；

检测广东番茄曲叶病毒（ToLCGuV）的引物为TGF和TGR，PCR扩增产物大小为81bp；

TGF：5’-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’；

TGR：5’-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’。

（2）采用CTAB方法提取待检病样品的总DNA。

（3）PCR反应

以步骤（2）中提取的总DNA为模板，步骤（1）中的4对引物为引物在同一体系中进行PCR反应。

（4）结果鉴别