[发明专利]一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法

权利要求书

1.一种肝癌组织特异性RNA干扰系统，其特征在于，由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子和位于其下游的shRNA序列，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV-eGFP-LoxP。

2.如权利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统，其特征在于，所述的shRNA序列为针对靶基因的shRNA序列。

3.权利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统的建立方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：构建AFP-Cre载体：

步骤1.1：取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP启动子序列，根据其序列改造设计并人工合成新的AFP启动子片段，以NheI和EcoRI限制性内切酶酶切pUC57质粒，T4连接酶连接，将AFP启动子片段克隆入pUC57质粒，形成含有AFP启动子片段的pUC57-AFP重组质粒，转化感受态细胞DH5α，扩增，抽提质粒；

步骤1.2：以pUC57-AFP重组质粒为模板，以Gecp-1，2为引物，常规PCR扩增获得AFP启动子片段；以pCAG-Cre为模板，以Gecp-3，4为引物，常规PCR扩增获得Cre片段；然后以AFP启动子片段和Cre片段为模板，以Gecp-1，4为引物，行PCR拼接获得全长目的基因片段AFP-Cre；

步骤1.3：用Spe I和Xba I限制性内切酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切，酶切产物电泳后回收7.0kb的载体片段，即为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段；

步骤1.4：将步骤1.2获得的目的基因片段AFP-Cre以同源重组法与步骤1.3获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段重组，构建成AFP-Cre重组质粒；

步骤1.5：转化感受态细胞DH5α，挑取转化子行菌落PCR鉴定阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序，测序没有问题的，再接种抽提质粒；

步骤1.6：表达载体包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞铺板，将AFP-Cre重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培养皿中常规培养；转染24小时后收取上清病毒液，高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；最终形成的AFP-Cre慢病毒颗粒即为AFP-Cre载体；

步骤2：构建LoxP-shRNA载体：

步骤2.1：以pSil02质粒为模板，以Gecp-5和Gecp-6为引物，采用常规PCR扩增获得片段A；以pSil02质粒为模板，以Gecp-7和Gecp-8为引物，采用常规PCR扩增获得片段B；以pSil04质粒为模板，以Gecp-9，Gecp-10，Gecp-11和Gecp-12为引物，采用常规PCR扩增获得片段C；以Gecp-5和Gecp-8为引物，以片段A、B、C为模板，行PCR获得片段D，即为U6-LoxP-CMV-eGFP-U6结构片段；

步骤2.2：以XhoI和EcoRI限制性内切酶分别酶切片段D和pSil02质粒，T4连接酶连接，将片段D克隆入pSil02质粒形成LoxP-shRNA重组质粒；

步骤2.3：转化感受态细胞，扩增，测序鉴定阳性克隆，接种阳性克隆后扩增，进行质粒抽提；

步骤2.4：表达载体包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞铺板，将LoxP-shRNA重组质粒与无内毒素包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培养皿中常规培养；转染24小时后收取上清病毒液，高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；最终形成的LoxP-shRNA慢病毒颗粒即为LoxP-shRNA载体；

步骤3：形成肝癌组织特异性RNA干扰系统：将AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体以1-5∶1比例混合溶于Opti-MEM液中，形成肝癌组织特异性RNA干扰系统。