[发明专利]一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法有效
申请号: | 201210556854.9 | 申请日: | 2012-12-19 |
公开(公告)号: | CN103088064A | 公开(公告)日: | 2013-05-08 |
发明(设计)人: | 樊嘉;史颖弘;彭远飞;丁振斌 | 申请(专利权)人: | 复旦大学附属中山医院 |
主分类号: | C12N15/867 | 分类号: | C12N15/867;C12N15/113;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00 |
代理公司: | 上海申汇专利代理有限公司 31001 | 代理人: | 翁若莹;王婧 |
地址: | 200032 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 肝癌 组织 特异性 rna 干扰 系统 及其 建立 应用 方法 | ||
1.一种肝癌组织特异性RNA干扰系统,其特征在于,由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成,AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成,其中,AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因,LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子和位于其下游的shRNA序列,LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子,所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV-eGFP-LoxP。
2.如权利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统,其特征在于,所述的shRNA序列为针对靶基因的shRNA序列。
3.权利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统的建立方法,其特征在于,具体步骤为:
步骤1:构建AFP-Cre载体:
步骤1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP启动子序列,根据其序列改造设计并人工合成新的AFP启动子片段,以NheI和EcoRI限制性内切酶酶切pUC57质粒,T4连接酶连接,将AFP启动子片段克隆入pUC57质粒,形成含有AFP启动子片段的pUC57-AFP重组质粒,转化感受态细胞DH5α,扩增,抽提质粒;
步骤1.2:以pUC57-AFP重组质粒为模板,以Gecp-1,2为引物,常规PCR扩增获得AFP启动子片段;以pCAG-Cre为模板,以Gecp-3,4为引物,常规PCR扩增获得Cre片段;然后以AFP启动子片段和Cre片段为模板,以Gecp-1,4为引物,行PCR拼接获得全长目的基因片段AFP-Cre;
步骤1.3:用Spe I和Xba I限制性内切酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切,酶切产物电泳后回收7.0kb的载体片段,即为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段;
步骤1.4:将步骤1.2获得的目的基因片段AFP-Cre以同源重组法与步骤1.3获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段重组,构建成AFP-Cre重组质粒;
步骤1.5:转化感受态细胞DH5α,挑取转化子行菌落PCR鉴定阳性克隆,接种阳性克隆,保种并分装送测序,测序没有问题的,再接种抽提质粒;
步骤1.6:表达载体包装、浓缩及滴度测定:选择生长旺盛期293T细胞铺板,将AFP-Cre重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培养皿中常规培养;转染24小时后收取上清病毒液,高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数,于293T细胞测定滴度;最终形成的AFP-Cre慢病毒颗粒即为AFP-Cre载体;
步骤2:构建LoxP-shRNA载体:
步骤2.1:以pSil02质粒为模板,以Gecp-5和Gecp-6为引物,采用常规PCR扩增获得片段A;以pSil02质粒为模板,以Gecp-7和Gecp-8为引物,采用常规PCR扩增获得片段B;以pSil04质粒为模板,以Gecp-9,Gecp-10,Gecp-11和Gecp-12为引物,采用常规PCR扩增获得片段C;以Gecp-5和Gecp-8为引物,以片段A、B、C为模板,行PCR获得片段D,即为U6-LoxP-CMV-eGFP-U6结构片段;
步骤2.2:以XhoI和EcoRI限制性内切酶分别酶切片段D和pSil02质粒,T4连接酶连接,将片段D克隆入pSil02质粒形成LoxP-shRNA重组质粒;
步骤2.3:转化感受态细胞,扩增,测序鉴定阳性克隆,接种阳性克隆后扩增,进行质粒抽提;
步骤2.4:表达载体包装、浓缩及滴度测定:选择生长旺盛期293T细胞铺板,将LoxP-shRNA重组质粒与无内毒素包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培养皿中常规培养;转染24小时后收取上清病毒液,高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数,于293T细胞测定滴度;最终形成的LoxP-shRNA慢病毒颗粒即为LoxP-shRNA载体;
步骤3:形成肝癌组织特异性RNA干扰系统:将AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体以1-5∶1比例混合溶于Opti-MEM液中,形成肝癌组织特异性RNA干扰系统。
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