[发明专利]一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法。

背景技术

原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55％。全国第三次死因回顾抽样调查报告显示：肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在城市和男性则是首位死因)。肝癌在诊断时多已晚期，其治疗方法有限，如何有效治疗肝癌是我国目前亟需解决的重大问题。

近年来，RNA干扰成为一种潜在的癌治疗方法。RNA干扰是一种特异性的基因沉默方法。自发现以来已经迅速发展成为基因研究的有力工具并成为一种具有极大潜在价值的治疗方法。迄今为止已有的研究已证实其在疾病治疗方面的有效性和可行性。肝癌是一种基因功能改变引起的疾病。近年来，系统生物学水平的研究取得前所未有的巨大进展，确立了诸多重要的致癌基因，这些癌相关基因的发现为肝癌治疗提供了前所未有的巨大机遇。此外，因为RNA干扰物质易于给入肝脏，肝肿瘤适合进行RNA干扰治疗(肝肿瘤动物模型已作为一个优良的研究模型广泛用于RNA干扰治疗的研究)。因此，RNA干扰治疗在肝癌治疗方面具有巨大的潜能。可以预见的是在不远的将来RNA干扰治疗一定会广泛应用于肝癌治疗。

但是，尽管RNA干扰作为一种治疗方法具有巨大潜力，要使其成为一种有效的治疗方法必须解决几个问题。这些问题包括RNA干扰的特异性，RNA干扰作用的持续性，RNA作用的效能等。RNA干扰表达必须局限于肝癌细胞内，非肝癌细胞(如正常肝细胞)应免于RNA干扰作用已避免和消除RNA干扰的副作用。这对于肝癌患者特别重要，因为肝癌患者多伴有肝硬化，剩余的正常功能肝细胞减少，肝功能储备有限。目前最常用的RNA干扰药物是化学合成的小RNA(siRNA)和基于质粒的III型启动子(Pol III启动子，如U6或H1)驱动的shRNA。siRNA和III型启动子驱动shRNA没有组织特异性，会沉默任何类型细胞的靶基因，因而可能会在RNA干扰治疗作用时不仅作用靶细胞，同时作用于非靶细胞。此外，siRNA或III型启动子驱动shRNA的作用时间短(很少超过一周或几周，而癌治疗作用必须能够维持至少更长的时间)；同时两者的转染效率低，细胞的摄入有限，这些是目前RNA干扰治疗应用的重要挑战。为了获得组织特异性、长期和高效的RNA干扰，一个可能的解决方案是应用组织特异性启动子(限制治疗性RNA干扰表达于靶细胞)结合慢病毒载体(借助慢病毒载体特性获得高转染效能和稳定长效的RNA干扰作用)来实现。AFP启动子是肝癌细胞的组织特异性启动子，高度特异于肝癌细胞，可以实现肝癌组织特异性表达。但是AFP启动子是II型启动子(Pol II)，虽可驱动基因过表达，但却不能直接驱动干扰物质shRNA的表达，本发明创造性地应用Cre/LoxP开关系统结合AFP启动，采用一种创新的设计，实现了AFP驱动shRNA表达。慢病毒载体是一种能够获得长期、高效体内外RNA干扰作用的强大工具，目前已被广泛应用于基础研究和转化医学研究。慢病毒干扰载体可以高效感染靶细胞(＞99％)将RNA干扰结构(如shRNA)整合入靶细胞的基因组，实现稳定表达，产生长效的RNA干扰基因沉默。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌组织特异性的RNA干扰系统及其建立和应用方法，该系统可以肝癌组织特异性地、高效地、长效地沉默靶基因，从而为RNA干扰治疗提供了一种有效的治疗工具，使肝癌RNA干扰治疗成为可能，为RNA干扰治疗应用于肝癌治疗铺平道路。

为了达到上述目的，本发明提供了一种肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)，其特征在于，由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成(图1(A))，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因(称为AFP-Cre结构)，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位于其下游的shRNA序列(称为LoxP-shRNA结构)，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV-eGFP-LoxP。