[发明专利]一种通过花药培养获得百脉根再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过花药培养获得百脉根(Lotus corniculatus Linn)再生植株的方法，属于牧草育种技术领域。

背景技术

百脉根(Lotus corniculatus Linn)原产于欧、亚温暖地带，是豆科百脉根属多年生牧草。具有产草量高、绿期长、蛋白含量高（孕蕾期粗白质含量在26.15%）、营养丰富、适口性好且家畜采食后不发生鼓胀等优点。百脉根具有耐热、耐水淹、耐瘠薄、耐酸等特点，是我国温暖湿润地区极有希望的优良牧草。因此，开展百脉根的育种研究工作对于南方草地畜牧业的发展具有十分重要的意义。

栽培百脉根为同源四倍体，自交不亲和，具有高度的杂合性，采用常规育种进程缓慢、效率差。利用花药培养技术不仅可以缩短育种周期、提高选择效率且可以得到性状丰富的单倍体或纯合二倍体材料。Guha(1964)、Maheshwari（1966)以毛曼陀罗（Datura innoxia mill.）的花药为外植体获得了再生植株，至此花药培养在植物细胞遗传学、遗传学和育种等方面得到了广泛应用。近年来，花药培养已与常规杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，形成了一套行之有效的育种技术体系，已经成为工程育种的重要组成部分，利用花药培养产生的DH（加倍单倍体）群体也是构建遗传图谱的优良群体。本发明以百脉根花药为材料，建立了一套适合百脉根简单、快速、稳定的花药培养体系，为百脉根的单倍体育种及其遗传作图群体DH群体的构建等提供前期准备工作。这对百脉根的遗传改良、新品种的选育及南方草地畜牧业的发展都有着极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获得百脉根(Lotus corniculatus Linn)单倍体植株的方法，即以百脉根花药为外植体，进行离体培养，花药内的小孢子发育成单倍体植株。

本发明方法包括外植体的准备、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化培养、芽生根的步骤，其具体如下：

a.外植体的准备：选单核靠边期的花药灭菌处理备用；

b.愈伤组织的诱导：无菌环境下剥出花药，接种于愈伤组织诱导培养基上，该培养基的配方为NB+2,4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT2.0mg/L，蔗糖90g/L，琼脂6g/L，pH5.8；接种密度为40-50个/皿，用封口膜封口后，放置于生化培养箱25℃暗培养至长出愈伤组织，然后利用NB+NAA0.3mg/L+2,4-D0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8继代培养，培养条件：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度1500-2000lx。其中NB为培养基代号，表1为配方成分；2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸；NAA为α-萘乙酸；KT为激动素。

c.愈伤组织的分化培养：将愈伤组织继代2-3次，每次15d；然后转入愈伤组织分化培养基，诱导芽的分化；分化培养基的配方为MS+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8；培养条件：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2000-2500lx；

d.生根培养：分化培养30d后，将产生的不定芽转入MS基本培养基进行不定芽复壮培养；不定芽长至2-3cm时转入1/2MS+0.5mg/L NAA，蔗糖10g/L，琼脂6g/L，pH5.8的培养基进行生根培养；培养条件为：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2500-3000lx。其中MS为培养基代号，表2为配方成分。

f.再生苗的获得：转入生根培养基15-20d后，开始炼苗。先将封口揭开，在人工气候箱中炼苗3d，保证每天浇适量蒸馏水；然后在光照培养间（温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度60-80%，光照强度2500-3000lx）炼苗3d后开始移栽，移栽前将苗根部残留的培养基冲洗干净，移栽到已经过灭菌的基质（蛭石：珍珠岩：营养土=5:3:2，可加少许0.5%的标典3721生根液）上室内培养10-15d后便可移栽到大田。

本发明以豆科重要牧草百脉根的花药为外植体，进行离体培养，从而快速高效获得具有亲本遗传基因的单倍体植株。单倍体植株加倍后，不仅可以缩短育种周期、提高选择效率且可以得到性状丰富、纯合原倍性材料。近年来分子生物学的发展，将单倍体作为转基因受体可以较少多倍体的复杂程度，更好的验证和分析基因功能；利用基因组学研究百脉根的特异性状也表现的越来越重要，花药培养构建DH纯系或DH群体是基因组学研究的理想材料。

附图说明