[发明专利]一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白(OsrHSA)可用于临床应用的方法。

背景技术

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。

目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点：一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在问题，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。

随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(OsrHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产OsrHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，M.et al.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders，C.W.etal，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产OsrHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。

本发明人的中国专利申请No.201010606635.8公开了一种从水稻种子中提取OsrHSA的方法，在该方法的基础上，本发明进一步对去除OsOsrHSA的内毒素含量和提高纯度到＞99.9999％的工艺进行研究，从而得到本发明的新技术方案，在此，将申请No.201010606635.8公开的内容全文引入本发明的背景技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种从转基因水稻种子的蛋白粗提液中分离纯化重组人血清白蛋白的层析方法，纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999％，内毒素含量达到我国人血清白蛋白的药典标准。

本发明的技术方案为：

一种用分离纯化重组人血清白蛋白(OsrHSA)的层析方法

包括以下步骤：

1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；

2)在结合条件下，将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II；

3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白目标物。

其中，所述阳离子交换层析的填料为Capto-MMC或Bestarose DiamondMMC；所述阴离子交换层析的填料为Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA；所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Bestarose HP；所述缓冲液包括洗杂缓冲液、平衡缓冲液I和平衡缓冲液II，其中洗杂缓冲液加入10-20％的乙醇，优选10％，平衡缓冲液I加入0-10％的乙醇，平衡缓冲液II加入5-15％，优选10％。

附图说明

图1是三种不同条件的Capto-MMC层析纯化效果与载量测定图；

其中，M为分子量标记，L为提取液样品，M1为对照组，M2为试验组1，M3为试验组2，FT为上样穿透液，M3FT为M3试验组的上样流穿液，600、660和730分别为上样600mL、660mL和730mL时的流穿液，wash为含OsrHSA组分的洗杂液，Elution为含OsrHSA组分的洗脱液。

图2是Capto MMC与Bestarose Diamond MMC进行初级纯化的纯度比较图；