[发明专利]一种用于检测宫颈癌致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测宫颈癌致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。

背景技术

宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第3个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第2位常见的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。2008年全球估计新发宫颈癌病例52.98万，死亡病例25.51万人，其中85%新发病例在发展中国家（Jemal，2011）。随着宫颈癌筛查的开展，发达国家宫颈癌的发病率及死亡率明显下降。

宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）的持续感染相关。HPV病毒是一种双链DNA病毒，具有球形外壳，直径55nm，主要感染皮肤粘膜上皮，导致不同病变。目前已经鉴定的HPV病毒超过200种，至少30种与生殖道粘膜感染相关。HPV妇女一生中80%可感染HPV，通常在8-10个月内被自然清除，只有少数(5%)妇女呈持续感染状态。根据HPV病毒与宫颈癌的关系分为高危型和低危型，高危型与宫颈癌相关，常见的亚型有：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、73、82，宫颈鳞状细胞癌中HPV16型最多见，其次是18、45、31和33型；宫颈腺癌中HPV18和45亚型较常见。低危型与生殖道疣相关，常见的亚型有：6、11、40、42、43、44、53、54、57、61、62、70、72、81、83、CP6108、MM4、MM7、MM9、MM9等。

在癌变初期，准确、快速、便捷地对其进行检测，是控制和治疗的关键。目前，多采取子宫颈刮片细胞学、宫颈管活体组织、阴道镜等检查方法对宫颈癌进行筛查。但是上述几种方法操作繁琐、准确率较低，对实验条件要求高，不适于宫颈癌的早期诊断。

核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR（real-timePCR）灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的问题，且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于宫颈癌含量极低的样本仍然无法检测，准确率较低。

branch-DNA(bDNA)支链DNA技术利用探针捕获待测目标，经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，可以对mRNA做精确的定量检测及动态水平研究。它克服了传统的real-time PCR技术中的种种缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大即可迅速得到更加精确的实验结果。除各种普通样本外，该技术对qPCR很难分析的血液样本与保存多年后mRNA高度降解的FFPE样本同样具有极高的准确度与重现性。

目前还未见利用bDNA技术对宫颈癌致癌基因的检测的相关报道，设计、特异性强的探针具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。该探针特异性好，降低了假阳性率。该方法经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，重复性，稳定性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针，包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；

其中，标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；

捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示；

预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。

本发明的探针设计是针对E6/E7mRNA的靶向性设计，特异性捕获Hela细胞中的E6/E7mRNA片段。