[发明专利]高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法

权利要求书

1.多食鞘氨醇杆菌工程菌株（Sphingobacterium multivorum）SWH-21，申请人已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏编号：CGMCC No.6883。

2.如权利要求1所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

1）重组质粒pUTPHNA的构建

根据环羟化双加氧酶编码基因序列设计引物phnNotl-F和phnNotl-R，利用PCR技术扩增环羟化双加氧酶编码基因，利用NotI分别酶切环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌，得到重组质粒pUTPHNA；

2）三亲杂交

采用三亲杂交方法，在助手质粒pRK600的存在下，将步骤1）得到的重组质粒pUTPHNA转入多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951的染色体上，得到了42个单菌株；

3）筛选

通过无机盐培养基平板培养、PCR扩增和电泳技术和菲降解能力检测对步骤2）的58个单菌株进行筛选，获得获得1个对菲降解能力最高的单菌株，即为多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883。

3.如权利要求2所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于步骤3）的筛选具体采用以下三个步骤：

（1）无机盐培养基平板检测

将获得的58个转化子同时转接到含有卡纳霉素（Kana，100μg/ml）无机盐培养基平板上，28℃培养48h，共得到42株单菌落；

（2）PCR扩增和电泳技术

利用phnS-F和phnS-R通过PCR扩增和电泳技术对上述步骤（1）得到的42个单菌株进行突变子筛选，得到42个单菌株；

（3）菲降解能力检测

采用气相色谱检测各个菌株对菲的降解能力，对上述步骤（2）得到的42个单菌株进行进一步的筛选，获得1株对菲降解能力最高的菌株，即为本发明的目标产物多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883。

4.如权利要求2所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于步骤1）的引物phnNotl-F和phnNotl-R优选序列如下： 

phnNotl-F：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAGCGGCG-3’

phnNotl-R：5’- CGGCGGCCGCTCATTCGGCCGCGTTAAGCT-3’。

5.如权利要求2所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于步骤1）中所说的大肠杆菌是含有λ-pir的大肠杆菌。

6.如权利要求6所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于所述的含有λ-pir的大肠杆菌选自E.coliDH5α（λ-pir），E.coli SM10（λ-pir），E.coliS17-1（λ-pir）或E. coli MV1190（λ-pir）。

7.如权利要求2所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于步骤2）中所用的引物phnS-F和phnS-R序列如下：

phnS-F:ACGCCACACTCGTAGACA

phnS-R:TACAGGAACGAGCGATTG。

8．权利要求1所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌的用途，其特征在于用于石油及多环芳烃的降解。

9．权利要求1所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌的用途，其特征在于用于生物修复菌剂的制备。