[发明专利]高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法。

背景技术

多环芳烃（PAHs）是一类广泛分布于环境中的含有2个苯环以上的有毒有害污染物，是石油的重要组成部分，由于潜在毒性、致癌性及致畸诱变作用，通过生物累积及食物链传递，给生物体、生态环境和人体健康带来极大危害，已引起各国环境科学家的极大重视。土壤生物修复，尤其是微生物降解，被认定是清除自然界中石油及多环芳烃的主要途径。

许多PAHs化合物均能被一种微生物或一个微生物群体全部或部分降解。积累在环境中引起污染的许多有机化合物，最初能抗微生物袭击，难以被降解。当环境条件发生变化后，某些微生物通过自然突变形成新的菌种，这些微生物经过一系列突变、基因重组及其他的遗传调控来创造新的酶促功能，以作用于外来化合物及其以后的代谢产物。这类基因发生遗传重组，或者和转移质粒结合，形成具有降解能力的质粒，也可以通过导入质粒的方法创造新菌株，获得新的降解能力。污染物的生物修复作用，本质上是开发利用微生物的新陈代谢能力及基因的多样性，把污染物转化为无污染的终产物，重新进入生物地球化学循环。

微生物因其较高的繁殖速度、代谢的多样性、遗传变异性，微生物的酶系能够以最快的速度适应外界环境的变化，能在各种不同的自然环境中生长，具有降解或转化有机污染物的巨大潜力。在过去的几十年，学者们已筛选出多种石油降解菌，包含细菌和真菌共100余属，200多种。本实验室从辽河附近石油污染土壤中分离获得了一株多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951，以其为材料，采用PCR技术，从中分离了环羟化双加氧酶编码基因，利用该基因构建了自杀性重组载体，并利用三亲杂交将该基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体DNA中，为获得高效降解石油及多环芳烃的工程菌株奠定了基础。

术语解释

cfu/ml：每毫升样品中含有的微生物群落总数。

cfu/g：每克样品中含有的微生物群落总数。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种高效降解多环芳烃的多食鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法。

本发明提供一株多食鞘氨醇杆菌工程菌株（Sphingobacterium multivorum）SWH-21，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏编号：CGMCC No.6883保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明利用的原始菌株是在辽河油田污染土壤中获得的一株多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951，该菌株对石油和多环芳烃具有一定的降解效果，周石油降解率为46.3%，多环芳烃降解率为31.6%。本发明应用基因工程手段，通过Tn5转座，将来自鞘氨醇杆菌的环羟化双加氧酶编码基因通过自杀性质粒整合到菌株CGMCC No.1951的染色体上，增强和扩大多食鞘氨醇杆菌的多环芳烃降解能力和降解范围。

上述鞘氨醇杆菌的具体菌株不做限定，凡具有环羟化双加氧酶活性的鞘氨醇杆菌均可。例如，保藏编号为CGMCC No.4400，CGMCC No.3326，CGMCC No.1951等鞘氨醇杆菌菌株均可。

本发明所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

1）重组质粒pUTPHNA的构建

根据环羟化双加氧酶编码基因序列设计引物phnNotl-F和phnNotl-R，利用PCR技术扩增环羟化双加氧酶编码基因，利用NotI分别酶切环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌，得到重组质粒pUTPHNA；

2）三亲杂交

采用三亲杂交方法，在助手质粒pRK600的存在下，将步骤1）得到的重组质粒pUTPHNA转入多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951的染色体上，得到了42个单菌株。

3）筛选

通过无机盐培养基平板培养、PCR扩增和电泳技术和菲降解能力检测对步骤2）的58个单菌株进行筛选，获得获得1个对菲降解能力最高的单菌株，即为多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883。

以上所说的多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的筛选主要采用以下三个步骤进行：

（1）无机盐培养基平板检测

将获得的58个转化子同时转接到含有卡纳霉素（Kana，100μg/ml）无机盐培养基平板上，28℃培养48h，共得到42株单菌落；