[发明专利]通过N端替换提高GH10木聚糖酶热稳定性的方法

权利要求书

1.一种改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、归属于GH10家族的木聚糖酶基因ATx10AM，其对应的基因和蛋白质序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.突变酶的构建方法：

依据Aus Xyn10A与来源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐热木聚糖酶蛋白质序列比对结果选择NRLTTGKNA(SEQ ID NO：3)作为拟替换序列，并依此设计突变引物XynCHNR1(5′CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3′)；

提取包含Aus Xyn10A基因的T载体(pUCm-T-Aus xyn10A)，依此为模板使用引物AusXyn10A基因的成熟肽引物Xyn10A-F1(5′-GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′)和引物XynCHNR1进行第一轮PCR，其后依pUCm-T-Aus xyn10A为模板，利用大引物PCR使用Xyn10A-R1(5′-GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′)和第一轮PCR产物作为引物进行第二轮PCR；将两轮PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-ATx10AM)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到突变酶的成熟肽基因序列。

3.ATx10AM表达质粒的构建、表达及纯化：

使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-ATx10AM，并对重组表达质粒进行序列测定；

用Sal I对pPIC9K-ATx10AM进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ATx10AM；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组木聚糖酶。