[发明专利]通过N端替换提高GH10木聚糖酶热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及GH10木聚糖酶改造及突变酶的高效表达方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。狭义上木聚糖酶特指β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)。β-1，4-内切木聚糖酶可以从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。目前所克隆的木聚糖酶大多属于F/10和G/11家族，第10家族木聚糖酶与第11家族相比具有底物特异性低、水解速度快、水解产物聚合度低，具有较大的研究和应用价值。木聚糖酶在造纸、食品、能源、饲料及环境等领域中具有广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。然而，目前工业生产的大多为原始菌直接发酵所得到的木聚糖酶，其最适反应温度大多在45-55℃左右，且热稳定性较差，大大制约了木聚糖酶在饲料、造纸等行业中高温环境下的应用，如Alves-Prado等在巴西塞拉多地区的土壤中分离到一株高产木聚糖酶的细菌Lysinibacillussp.strain P5B1，该木聚糖酶的最适作用温度为55℃；Menon等从印度海洋化工研究院实验盐农场的沉积物中筛选分离出一株产耐盐木聚糖酶的短小芽孢杆菌GESF1，并对该木聚糖酶进行了分离纯化和酶学性质研究，该酶的最适作用温度为40℃，虽然这些木聚糖酶其它酶学性质较好，但由于热稳定性问题较难被应用在高温制造行业。因此寻找有效途径和手段，提高木聚糖酶在高温环境中的稳定性及催化活性已成为国内木聚糖酶工业的当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种GH10木聚糖酶Aus Xyn10A热稳定性改造及重组突变酶的高效表达和纯化方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种提高GH10木聚糖酶最适温度及热稳定性的方法，其特征在于，依据Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)与耐热木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白质序列比对及计算机预测分析结果，运用基因工程的方法将耐热酶的N端区域序列替换Aus Xyn10A的相应序列。获得的突变酶命名为ATx10AM，其对应的基因和蛋白质序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

所述的木聚糖酶的活性测定方法：

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

所述突变酶的构建和表达方法：

(1)突变酶的构建：依据Aus Xyn10A与来源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐热木聚糖酶蛋白质序列比对及计算机预测分析结果选择NRLTTGKNA(SEQ ID NO：3)作为拟替换序列，并依此设计突变引物XynCHNR1(5′-CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3′)。

提取包含Aus Xyn10A基因的T载体(pUCm-T-Aus xyn10A)，依此为模板使用引物AusXyn10A基因的成熟肽引物Xyn10A-F1(5′-GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′)和引物XynCHNR1进行第一轮PCR，其后依pUCm-T-Aus xyn10A为模板，利用大引物PCR使用Xyn10A-R1(5′-GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′)和第一轮PCR产物作为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-ATx10AM)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到突变酶的成熟肽基因序列。