[发明专利]一种截短的甘露聚糖酶的设计与制备

权利要求书

1.一种表达水平和催化催化效率高的dAus Man5A截短酶，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.截短酶工程菌的构建和表达方法：

(1)截短残基的选定：以里氏木霉β-甘露聚糖酶的三维结构(1QNR)为模板，用Modeller9.9软件模拟出Aus Man5A的三维结构。利用Discovery Studio 3.0Client和PyMOL软件对模拟出的三维结构进行分析，确定末端的无序残基；

(2)截短酶dAus Man5A基因的合成：基于上面设计的截短酶基因序列，采用PCR技术将Aus Man5A的基因序列5′和3′端分别去掉9个碱基；PCR涉及到的两对引物分别为：

dN3C3-F：CTCGAGAAAAGAAGCACCTCCGGCCTCCAATTC，

dN3C3-R：GCGGCCGCTTA A ATAGCAGCA ACATGATCCGTC；

以重组质粒pUCm-T-man5A为模板、dN3C3-F和dN3C3-R为引物进行PCR反应，反应条件为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；10℃永久保存；将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段dAus man5A并将它与pUCm-T载体连接，将连接产物热激转化入大肠杆菌JM109感受态细胞后进行蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定及测序鉴定；

(3)重组表达质粒的构建：将测序正确的pUCm-T-dAus man5A及pPIC9K^M分别用XhoI和Not I进行双酶切，回收目的片段并进行连接和转化。然后对重组菌进行筛选和鉴定，将经过初步鉴定的质粒送至上海生工进行测序验证，测序正确的重组质粒命名为pPIC9K^M-dAusman5A；

(4)GS115/dAus man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定：将测序正确的pPIC9K^M-dAus man5A经Sac I线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，先经MD平板筛选后再用G418筛选高拷贝的GS115/dAus man5A重组子，将高拷贝的重组子按照毕赤酵母表达手册上的标准流程进行诱导表达，并对发酵液进行活性测定和酶学性质初步鉴定。