[发明专利]一种前列腺癌荧光定量PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测前列腺癌细胞或组织中DD3^PCA3基因存在的荧光定量PCR(聚合酶链式反应)诊断试剂盒，适用于定性或定量检测前列腺癌细胞或组织中DD3^PCA3基因的存在。

背景技术

前列腺癌(prostate carcinoma，PCa)的发病率在全球范围内呈上升趋势，在欧美国家居男性恶性肿瘤第2位。我国随着人口老年化，前列腺癌发病率日渐增加，成为危害我国老年男性健康的重要因素。前列腺癌的自然史十分独特，除少数病例外，其生长大多比较缓慢，平均倍增时间和转移较慢，潜伏期较长，有些甚至终生不被发现。许多患者早期没有任何主观不适，等到出现相应临床症状时已至疾病晚期，从而错过了最佳治疗时机。因此，临床上探寻前列腺癌新的诊断方法以协助前列腺癌的早期诊断，一直是人们研究的热点。自1979年Wang等首先从前列腺组织内分离和提纯前列腺特异性抗原(PSA)以来，PSA在临床上得到了大量的研究和应用。PSA属激肽释放酶家族蛋白，为一种丝氨酸蛋白酶，是目前临床上应用最广泛的前列腺肿瘤标志物，研究表明PSA是前列腺组织特异性抗原，而不是PCa特异性抗原，故PCa可引起血清PSA水平升高，但是良性前列腺增生、前列腺炎、急性尿滞留、前列腺的各种手术操作和有关前列腺的各种检查(如DRE)均可引起血清PSA水平的升高，疾病特异性比较差。当PSA＞10ng/mL时，检出PCa的几率约70％；当PSA处于灰区(4～10ng/mL)时，仅有25％为PCa。PSA处于灰区时，应用年龄校正的PSA正常值、PSA密度(PSAD)、PSA速率(PSAV)、游离PSA与总PSA比值(F/T)等衍生指标虽然能提高诊断的特异性、减少约30％的不必要的穿刺活检，但也使25％的患者漏诊，约15％的PCa患者血清PSA小于4ng/mL。为寻找对PCa发生、发展及预后进行监测的标志物，许多学者从多方面、多角度对PCa进行着探索性研究。基于敏感性、特异性、创伤性及实用性等方面的优势，PCa肿瘤标志物的研究日益受到人们的重视。近年来，随着对PCa分子水平研究的不断深入，已分离到一种新的PCa标志物，即DD3(differential displaycode 3)，DD3PCA3基因是1999年Bussemakers MJ等发现的一种功能为非编码RNA的基因，定位于人类染色体9q21～22，全长约25kb，由4个外显子和3个内含子组成。在前列腺的上皮细胞内表达一种非编码的mRNA，它参与多聚腺苷酸的转录但并不产生细胞质蛋白，其功能类似于结构RNA，表达水平与PCa关系非常密切。研究表明DD3基因在PCa组织中的表达水平是与其相邻的正常前列腺组织中的10-100倍，而且在人体的其他正常组织中都不表达，在其他肿瘤组织中的表达极其微量，并且在前列腺炎和前列腺增生组织中其表达也处于较低水平，这表明DD3基因是PCa的特异性标志基因。当有少量的前列腺组织恶变时，DD3^PCA3基因即可过量表达，并能随癌细胞排放进入血液、前列腺按摩液、精液以及尿液，它们可稳定存在于这些体液中并能够被精确检测。1996年美国应用生物系统公司(ABI)推出荧光定量PCR仪，实现了PCR从定性到定量的飞跃。由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点迅速成为了分子生物学研究中的重要工具。目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。因此，应用荧光定量PCR技术开发一种用于快速检测前列腺癌细胞或组织中DD3^PCA3基因的试剂盒是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、重复性好且准确度高的前列腺癌荧光定量PCR诊断试剂盒，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点。

本发明主要包括试剂盒的组成和使用方法。

前列腺癌荧光定量PCR检测试剂盒包括：(1)总RNA提取试剂，(2)PCR反应预混液，(3)热启动Taq酶，(4)阳性标准品，(5)阴性质控品；

具体的说：

(1)总RNA提取试剂

总RNA提取试剂成分为：Trizol试剂，40mL，DEPC处理水，1mL×2

(2)PCR反应预混液