[发明专利]一种神经元分离和培养方法及试剂

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种神经元体外分离和培养方法。

研究背景

神经元，又称神经细胞，是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4～120微米。核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质（旧称尼尔小体），还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。

在神经系统发育过程中，中枢神经系统经历了细胞数量和体积的增长及细胞连接形成改变过程。分化的神经元一经产生，便不可能再进行分裂，神经元的正常分化过程一旦受损， 即有可能影响突触联系的正常建立等一系列过程。对神经元损伤的机制及其防治，一直是人们感兴趣的问题。随着对神经元功能的了解，它已逐渐成为神经生物学领域研究的热点。但由于在体内神经元与其它神经细胞以及其他组织细胞混杂存在，妨碍了其生物学功能的研究及应用。因此需要对神经元进行体外培养并纯化，才能深入了解其形态结构和生物学功能。

由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂增殖，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长，其胞体伸出许多又长又细的突起，在取材过程中容易损伤其突起。在胚胎发育过程中，神经系统发育较早。出生后，神经系统发育基本完成，很多神经元此时已经长出突起，取材于该时期的脑组织对神经元的损伤较大。胚胎时期的神经元分化程度较低，体外生存能力强，该时期神经元之间的联系较少，取材过程中造成的不可逆伤害较小，易于成功培养。

体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。目前神经元的培养分为有血清培养和无血清培养，有血清培养提供细胞培养所必须的营养成分，促进细胞增殖和DNA 的合成，但也为神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等其它神经细胞提供了丰富的营养，但也使得培养的神经元很难分离开。无血清培养技术不利于有丝分裂细胞的生长，可防止非神经元过度增殖，可提高培养的神经元纯度。采用无血清培养能通过添加某些成分，而且可选择性地促进和控制神经元的生长。

目前尚未见有关神经元体外分离或培养方法的专利文献公开，虽然神经元采用常规细胞培养技术，能够在一定程度上达到培养的目的，但存在着与神经胶质细胞，成纤维细胞等其它杂细胞很难分离以及体外培养存活困难等问题，不能满足细胞实验的要求。本室参照国内外培养分离神经元的方法。根据多年的实验研究，改进了大脑皮质神经元的体外培养方法，建立了一种稳定、可靠的获得神经元的方法，为了解神经元的结构与功能，阐明其在脑血管疾病、神经系统疾病中的作用研究提供成功的实验模型。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养神经元的方法，使之简单易行，培养获得的神经元生长良好，纯度高，产量大，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。

采用以下方案来实现本发明的目的。一种体外分离和培养神经元的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后胰酶消化、筛网过滤离心、细胞原代培养等4个实验步骤。此外还可包含神经元鉴定的步骤。

大脑皮质组织分离

孕鼠颈椎脱臼致死，无菌条件下取出胚胎，然后在无菌条件下取胎鼠两侧大脑半球放入培养皿中，剥离并去除皮层血管组织和软脑膜。

优选方案为：孕15-17天的大鼠颈椎脱臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪开腹部至两侧，无菌条件下取出串珠状胚胎，放入盛有1×PBS的培养皿中，然后在无菌超净台内冰床上取胎鼠两侧大脑半球放入盛有1×PBS的培养皿中，用眼科镊夹取动物双侧大脑皮质置于盛有1×PBS的培养皿内，仔细剥离并去除皮层血管组织和软脑膜，再将大脑皮质移至另一个盛有1×PBS的培养皿内。