[发明专利]P16免疫细胞化学试剂盒及其制备用多肽序列

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于标记人类细胞中P16蛋白的免疫细胞化学试剂盒制备方法和用于制备试剂盒中相关单克隆抗体的几种多肽成分。

背景技术

人类P16蛋白是细胞中的一种保护性蛋白，能够防止人体细胞癌变，起到阻止细胞过度增殖的作用。人类P16蛋白的编码基因为CDKN2A，位于9号染色体短臂上。P16蛋白能够与周期素依赖性激酶4结合并抑制其活性，使细胞停留于G1期，无法持续增殖。故而，P16是一种抑癌蛋白。细胞中，P16蛋白的表达通常受到另两种抑癌蛋白：P53和RB的调控，处于低水平状态。

宫颈癌及其癌前期细胞中，P16蛋白表达量常会异常增加，其原因在于当宫颈细胞处于癌变早期时，抑癌蛋白P53和RB的功能常常处于缺失状态，因此P16蛋白的合成表达被从抑制状态中释放了出来。不过，此时细胞中虽有P16蛋白过量表达，因无法抵抗P53和RB功能缺失带来的不利作用，仍将进入持续增殖状态，进而转变为癌细胞。故而，我们如在宫颈癌前期细胞中考察P16蛋白表达量，就可以预测这些细胞的转归命运。目前，已经知道，宫颈癌Hela细胞株P16蛋白表达量明显高于正常水平，是典型的P16阳性细胞株。

在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中，部分癌细胞可因其P16蛋白编码基因的外显子突变或启动子甲基化的关系，P16蛋白表达量显著降低。研究表明，较之周围P16蛋白表达水平较高的同类型癌细胞而言，这些P16蛋白表达量较低的癌细胞的恶性程度通常更高。因此，如在恶性胸水或腹水检测到这类P16表达为阴性的胃癌或肺癌细胞，说明患者预后较差。

免疫细胞化学是指利用针对某种蛋白的特异性抗体对细胞中该蛋白表达情况进行检测的一种实验方法。通常分为三步：（1）以第一抗体（主要使用单克隆抗体，比如小鼠抗人P16单克隆抗体）识别细胞中的目标蛋白，（2）以带有酶分子标记的第二抗体（主要使用多克隆抗体，比如：兔抗小鼠IgG多克隆抗体），识别第一抗体，（3）以酶分子底物（如：辣根过氧化物酶底物为二氨基联苯胺）使被标记目标蛋白显色。免疫细胞化学技术被广泛应用于生命科学和医疗实践工作中，用以判断未知细胞的组织学来源、病理学性质和分子生物学特征。

免疫细胞化学中所用的单克隆抗体（即：第一抗体）来自于单抗制备技术。这种技术诞生于1975年，当时Kohler和Milstein两人发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。目前，单克隆抗体的杂交瘤制备技术广泛用于抗体的工业化生产中。其生产流程主要是先采用某种特定的抗原，比如：蛋白类抗原，注射入小鼠皮下，待免疫过程完成后，收集对该抗原具有反应性的脾细胞（实际是分泌单克隆抗体的B细胞），然后将其与骨髓瘤细胞融合，筛选出对免疫原（或抗原表位）最具反应性的杂交瘤克隆，进行大规模扩增，再从扩增瘤细胞所用的培养基中分离纯化出目标抗体即可。单抗制备技术获得的抗体多为IgG抗体，它们可在体外条件下对抗原成分中的特定表位进行免疫识别和结合。需要注意的是，免疫动物所用的抗原物质应有足够大的分子量，如果所用抗原物质分子量过小，则有可能因为无法刺激B细胞增殖而不能获得所需的单克隆抗体。为此，通常建议采用完整的蛋白分子对小鼠进行免疫。但也有时候，为了制备针对蛋白分子中某个抗原表位的单克隆抗体，有考虑采用蛋白分子的部分肽段来进行抗体制备的做法。此时，如免疫动物所用肽段分子量过小，例如：只含10-20个氨基酸时，必须将此肽段先偶联到一个分子量较大的载体蛋白上，然后以偶联物免疫动物，再通过酶联免疫吸附检测法筛选出对该肽段有较高反应性的杂交瘤克隆，最后对这些瘤细胞加以大量扩增，即可得到针对某特定抗原表位的单克隆抗体产物。

免疫反应机制上，抗原和抗体的识别和结合是特异性的，需要双方分子之间具备相互契合的空间结构，就如同是锁和钥匙之间的一一对应关系那样。但是，抗原抗体的结合过程中，两者的空间构象并不是一成不变的，相反，这是一个相互诱导的过程。通常来说，抗原分子的出现可以诱导抗体分子产生折角和弯曲，以利于抗原分子进入结合位点，实现两者更为密切的结合。而抗体分子在识别抗原表位过程中也可以打开抗原分子表面的屏障，深入到后者内部的识别区位中，更好地与抗原结合。利用抗原抗体分子在识别过程中的这些构象改变机制，现已能够人为设计出一些特殊的抗体分子，通过诱导抗原分子发生各种预定的构象乃至于一些化学键的改变，用以实现某些特定的生物学或化学目标。比如：抗体酶。