[发明专利]用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是涉及一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法。

背景技术

单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合的B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏或淋巴结中分离出来的，免疫后的脾脏和淋巴结中含有大量分泌高亲和力和高特异性抗体的B细胞。选择合适的动物免疫方案是获得高质量的McAb的首要前提。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。

传统的用于细胞融合的淋巴细胞的多采用腹腔及皮下注射免疫的方法制备，制备时采用的抗原包括颗粒性抗原和可溶性抗原。

颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。以细胞性抗原为例，第一次腹腔或尾静脉注射1×10⁶~1×10⁷细胞/鼠，间隔2~3周重复注射1~2次，融合前3d用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。

可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，应先制备成人工免疫原，再加佐剂。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。一般取50~100μg抗原与等量完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后腹腔或背部皮下多点注射，以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂腹腔或皮下注射，共3~5次，一般在融合前3d腹腔或静脉注射无佐剂抗原50~100μg加强免疫。这是目前最常用的免疫方式。

然而，腹腔及皮下注射免疫的方法制备用于细胞融合的淋巴细胞，免疫周期较长，至少需要4次以上的免疫后才能进行细胞融合，免疫时间至少需2个月以上；同时对抗原的需求量大，一般需100~200μg/次/鼠，这大大地增加了单克隆抗体制备的成本，特别是对价格昂贵的抗原。

发明内容

基于此，有必要提供一种免疫时间较短且较节省抗原的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法。

一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，用于单克隆抗体制备，包括如下步骤：

步骤一、麻醉并固定小鼠；

步骤二、在第0天，用抗原对步骤一得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，所述10个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2μg；

步骤三、在第3天用所述抗原对步骤二得到的小鼠的所述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2μg；

步骤四、在第7天用所述抗原对步骤三得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21μg；

步骤五、在第12~14天，取步骤四得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到所述用于细胞融合的淋巴细胞。

在一个实施例中，所述抗原为颗粒性抗原。

在一个实施例中，所述抗原为用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原。

在一个实施例中，步骤一中，所述小鼠为6~8周龄的雌性BALB/C小鼠。

在一个实施例中，步骤一中，所述麻醉小鼠的操作具体为用苯巴比妥钠对所述小鼠进行腹腔注射，剂量为100mg/kg。

在一个实施例中，步骤五中，所述淋巴结为两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿腘淋巴结中的至少一个。

在一个实施例中，步骤五中，还包括检测小鼠血清效价在1：3200以上的操作。

这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，具有免疫速度快的优点，12~14天即可完成免疫；同时需要的抗原量少，总共仅需70μg/鼠。与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法免疫时间较短且较节省抗原，从而有效地降低单克隆抗体制备的时间和成本。

附图说明

图1为一实施方式的用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法；

图2为小鼠的接近淋巴结的10个位点的示意图；

图3为用于研磨制成单细胞悬液并用于细胞融合的小鼠的淋巴结的示意图。

具体实施方式