[发明专利]一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建、表达及应用

说明书

技术领域

本发明所属生物催化技术领域，特别涉及一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建和表达，及一种利用基因工程菌发酵液转化合成β-丙氨酸的方法。

背景技术

β-丙氨酸是自然界中唯一存在的一种β型氨基酸，是生物体内合成泛酸的前提。泛酸是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)生物合成的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢参与蛋白质、脂类和糖的代谢。

β-丙氨酸是一种重要的多用途的有机原料，可合成聚合β-丙氨酸，用于水处理工业和染料等生产；可合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，用于医药工业；也可用于美容、食品、饲料及化工等领域。β-丙氨酸具有较宽广的应用领域，有着非常大的市场需求。

获取β-丙氨酸的途径，可由丝胶、明胶、玉米蛋白等物质的水解、精制得到，但原料来源有限，成本高，目前工业上主要通过化学方法生产。化学法包括以下几种方法：(1)丙烯腈法；(2)丙烯酸法；(3)琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法；(4)β-氨基丙腈法。化学法容易产生污染气体，且有些反应环境是在高温高压的条件下反应，副产物有毒，产物的分离纯化比较困难。

酶制剂作为生物催化剂的重要组成部分，其催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等特点，所以酶的应用受到越来越广泛的关注。

β-丙氨酸在生物体内有很多代谢途径。其中在L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶的作用下将L-天冬氨酸的α位羧基脱去生成β-丙氨酸和CO₂，该反应基本不可逆。该酶在自然界中获利非常低，直接从天然菌株中筛选高产菌株非常困难。因此通过基因工程的方法来提高该酶的活性成了使其应用的唯一方法。

1996年(Patend Number：5834259)美国NSC技术有限公司通过基因克隆的方法，将E.coli K12菌株的PanD基因克隆到质粒pBR322，转化E.coli构建成含有PanD的菌株NS3291，用于拆分DL-天门冬氨酸制备D-天门冬氨酸。

1999年，Nieole Dusch(Applied And Environmental Microbiology，Apr.1999，p.1530-1539)将C.glutamicum的panD基因(panDc.g)与E.coli的panD基因(panDE.c)克隆到双功能质粒表达载体pZ8-1(含tac启动子)中，使得在C.glutamicum与E.coli中都能进行表达从而对基因进行分析。其中在C.glutamicum中，通过转入含panDc.g的pZ8-1来加强panDc.g的表达，PanD活性提高了288倍。但作者着眼于泛酸的积累，并未对panDc.g基因的产β-丙氨酸进行继续的研究。

专利CN 101210230A中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶基因克隆并进行异源表达，但是合成β-丙氨酸的能力只达到2.94g/L，离真正应用还有很大距离。其他专利对L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶进行异源表达的报道几乎没有，因此找到一种活性较高的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶基因是实现β-丙氨酸生产的决定性因素。

发明内容

本发明是为了克服自然界筛选产酶高活力菌株比较困难，并且现有的利用大肠杆菌进行异源表达的基因工程菌所得到的酶活性不高的问题，提供一种新的从酶基因库中挖掘的酶基因，得到一种合成能力强、酶活较高的产β-丙氨酸的工程菌，以及这种高产工程菌的构建、表达和纯化，及其全细胞转化和发酵液直接转化合成β-丙氨酸的方法。本发明所采用的技术方案是：

一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，所述的方法是：通过基因工程的方法PCR得到植物乳杆菌的PanD基因，并在基因两端加上NdeI和XhoI酶切位点，并将基因构建到pET-32a(+)载体中，得到PanDL.p基因的高表达载体pET-32a(+)-panDL.p，然后将高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产β-丙氨酸的基因工程菌。基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的30～50％，实现了目的蛋白的高效异源表达。对目的蛋白进行纯化，得到了纯度达到95％以上的目的蛋白。

本发明中所述产β-丙氨酸的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。

本发明中所述的产β-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。