[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

权利要求书

1.一种rhG-CSF的纯化方法，该方法包括以下步骤：

a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；

b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；

c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；

d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；

e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；

f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。

2.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，所述对复性产物进行阴离子柱层析处理方法如下：

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

使用平衡液（20mmol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min，平衡8-10倍柱床体积，

样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其pH值为8.2，然后超滤浓缩至复性体积的1/10，即为上样液，

上样：上样时泵流速为8.0-49.9ml/min，上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积，

洗脱：使用预洗液（20mmol/L pH7.8 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，洗脱2-4个柱床体积，然后将进液管换至洗脱液（20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL）中，开始目标峰洗脱，收集OD₂₈₀大于0.3洗脱峰。

3.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，所述对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，方法如下：

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

    平衡：使用平衡液（20mmol/L pH4.5 HAc-NaAc缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min，平衡8-10倍柱床体积，

上样：上样液为上步得到的OD₂₈₀大于0.3的洗脱液，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，开始上样，上样结束后，换至平衡液中，平衡2-4个柱床体积，至记录笔回至基线，用预洗液（20mmol/L pH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，至杂质峰洗下为止，换至洗脱液(50mmol/LpH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL进行洗脱目的峰，收集OD₂₈₀大于0.3的洗脱峰。

4.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，所述对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，方法如下：

反相填料层析

采用Pharmacia公司的预装型SOURCE 5RPC 4.6/150柱（粒径5μm，4.6×150mm、柱温度2-6℃，流速1.0ml/min），配制洗脱液A为含100mmolNaCl溶液10mmol pH= 8.0 Tris-HCl缓冲液，洗脱液B为含100mmolNaCl、 50%乙腈的10mmol pH= 8.0 Tris-HCl 缓冲液，先用洗脱液A洗脱；再用梯度20％-80％洗脱液B洗脱，15-35分钟收集样品峰，被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩后保存在2-8℃条件下。