[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法。本发明在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较，可以大幅度地提高重组人粒细胞刺激因子的纯度、比活及稳定性。

背景技术：

重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）是特异作用于粒系祖细胞、促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化的造血生长因子。具有以下功能：

1.促进骨髓移植后中性粒细胞计数增加。 

2.癌症化疗引起的中性粒细胞减少。 

3.骨髓异常增生综合症伴发的中性粒细胞减少症。 

4.再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。 

5.先天性、特发性中性粒细胞减少症。

重组人粒细胞集落刺激因子已经可以通过基因重组生物工程技术进行量产。但其纯化工艺经过多年研究始终难以解决其纯度问题，且比活下降明显，如现有技术“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立” 中国生物化学与分子生物学报 1998, Vol. 14 描述了以下技术方案：稀释复性蛋白，之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ蛋白比活性达3.4×10⁸U/mg，每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达1.06×10¹¹U/mgＵ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底，用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性。

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化《微生物学免疫学进展》 1998年02期 描述了以下技术方案：包涵体变性复性后，ｒｈＧ－ＣＳＦ的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了ｒｈＧ－ＣＳＦ，比活性达1.57×10⁸U/mg，纯度大于９８％。

本发明经过对不同纯化工艺的研究，筛选出一种纯化方法，其技术方案是在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。包括步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。

同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，rhG-CSF电泳纯度由90％提高到99％，HPLC纯度由90％提高到99％，其比活由0.8×10⁷U/mg提高到3×10⁸U/mg。可见，采用本发明的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高rhG-CSF的纯度、比活，以及稳定性。

发明内容：

本发明提供一种rhG-CSF的纯化方法，该方法包括以下步骤：

a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；

b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；

c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；

d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；

e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；

f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。

其中步骤a-c属于现有技术，可以根据现有技术中的方法获得。

本发明所述的步骤d-f属于纯化步骤，属于本发明的技术方案，其中，优选的技术方案如下：

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

使用平衡液（20mmol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。

样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其pH值为8.2，然后超滤浓缩至复性体积的1/10，即为上样液。

上样：上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。