[发明专利]荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法

权利要求书

1.一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法是：将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入适量微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；

(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体； 

(3) 若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共1 mg。

4.一种基于权利要求1所述方法的荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法，其特征在于，其过程包括：将经过前处理的葡萄藻液加入二甲基亚砜水溶液和尼罗红水溶液，二甲基亚砜辅助尼罗红进入葡萄藻细胞，使胞内脂质与尼罗红生成荧光产物；于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光谱，获得被测葡萄藻的荧光发射光强度（I）；将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测葡萄藻样品中脂质含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

 (1) 取200 μL经前处理的葡萄藻液于荧光测量皿中，依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液各200 μL，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度（I）；同时，取200 μL葡萄藻培养液于另一荧光测量皿中，依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液各200 μL，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度（I_B），以此为对照；被测葡萄藻中脂质的相对荧光强度值I_S=I-I_B；

(2) 以三油酸甘油酯为脂质含量测定的标准品，在5个1 ml的EP离心管中依次加入200 μg/mL的三油酸甘油酯DMSO水溶液[DMSO含量为3%(V/V)] 0、50、100、150和200 μL，并用蒸馏水补齐至200 μL，依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液200 μL，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的相对荧光发射光强度值（I_R），以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、I_R为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到线性拟合方程I_R=f(m)；

(3) 以步骤(1)中测得葡萄藻中脂质的相对荧光强度值I_S替代步骤(5)线性拟合方程I_R=f(m)中的I_R，通过计算即可求得200 μL被测葡萄藻液中脂质的质量m_s（单位为μg）；

(4) 200 μL待测葡萄藻液的干藻质量M_s (单位为μg)可用干重称量法测定，被测葡萄藻的脂质含量C_L=(m_s/M_s)×100%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以1 s / 1 s (开/关)间歇超声处理15~25 s。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，3 μg/mL尼罗红溶液的配制方法为，称取1.5 mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml。