[发明专利]荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法

说明书

技术领域

本发明属于能源微藻——葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种利用荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法。

背景技术

葡萄藻（Botryococcus）属绿藻门（Chlorophyta）、共球藻纲（Chlorophceae）、绿球藻目(Chlorococcales)，葡萄藻科（Botryococcaeae），是一种世界广布的能源微藻。该属中的布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）因脂质的含量高（可达细胞干重85％）、且组成和结构与化石原油相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的研发热点之一[Metzger & Largeau. Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol. 2005, 66: 486–496]。建立快速、微量、可靠的脂质含量检测技术是开展葡萄藻等微藻种质改良和培养模式优化等研发的重要基础，国内外已将尼罗红荧光法成功地用于小球藻等微藻的脂质含量快速检测[王金娜等. 产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测. 生物物理学报. 2010, 26(6): 472-480]。但值得指出的是，葡萄藻细胞不像小球藻等微藻细胞那样以游离的单细胞形式存在，而通常是由几十至上百个细胞形成集落。这种集落状的细胞团因体积大且易于下沉而难以在培养液中均匀分布，从而严重影响应用尼罗红荧光法检测其脂质含量的可行性与准确性。正因如此，目前在葡萄藻研发中仍多沿用传统的干重法检测其脂质含量，这也是导致多年来国内外葡萄藻育种、培殖和深加工等方面研发进展缓慢的重要原因之一[Yaming Ge, et al.  Growth characteristics of Botryococcus braunii 765 under high CO₂ concentration in photobioreactor. Bioresource Technology. 2011, 102(1): 130–134]。因此，迫切需要建立一种方法，能将集落状的葡萄藻细胞团制备成能均匀分布的单细胞或由几个细胞组成的小细胞团，以满足荧光光度测定法对样品的要求，从而将具快速、微量、可靠的尼罗红荧光脂质含量检测技术用于葡萄藻的研究与开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法是：将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖（Xanthan gum），然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。

该方法具体包括以下步骤：

(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入适量微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；

(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体； 

(3) 若没有，则可用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数。

所述微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共1 mg。

本发明进一步提供了基于前述方法的荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法，其过程包括：将经过前处理的葡萄藻液加入二甲基亚砜水溶液和尼罗红水溶液，二甲基亚砜辅助尼罗红进入葡萄藻细胞，使胞内脂质与尼罗红生成荧光产物；于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光谱，获得被测葡萄藻的荧光发射光强度（I）；将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测葡萄藻样品中脂质含量。

该方法具体包括以下步骤：